对GB 8538-216《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》中产气荚膜梭菌检验的研究与改进

󰀡doi:10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2020.14.056Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测对GB 8538-216《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》中 产气荚膜梭菌检验的研究与改进Research and Improvement of Clostridium Perfringens Test in GB 8538-2016 National Standard for Inspection of Natural Mineral Water for Drinking◎ 黄薇臻（南宁市食品药品检验所，广西 南宁 530007）(Nanning Testing Institute for Food and Drug Control, Nanning 530007, China)Huang Weizhen摘 要：以中国检科院测试评价中心（ACAS）组织的矿泉水中产气荚膜梭菌的检测能力验证、测量审核为例，实验检验使用标准GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》，实验过程滤膜上的菌落在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）经24 h厌氧环境培养后黑色菌落不明显，甚至不生长黑色菌落影响后续确认性实验，以及确证性实验中含铁牛乳培养基“暴烈发酵”实验现象不明显，针对此现象进行研究与改进。关键词：产气荚膜梭菌；检验；改进Abstract：Taking the testing ability verification and measurement audit of clostridium perfringens in mineral water organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Sciences (ACAS) as an example, the test used the process of the experiment, black colonies on the filter membrane were not obvious after 24h anaerobic culture of sulfite - improvement were performed based on this.中图分类号：R123.1standard GB 8538-2016 Inspection Method for Drinking Natural Mineral Water in National Standard for Food Safety”. In polymyxin - sulfadiazine (SPS). And there was no black colonies which influenced subsequent confirmatory experiments. The “violent fermentation” of iron-containing milk medium was also not obvious in the confirmatory experiment. Research and Key words：Clostridium perfringens; Testing; Improvement产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎常见的病原菌，该菌能引起气性坏疽和食物中毒。由该菌引发的食物中毒为食入被大量（108～109）细菌繁殖体污染的食物（主要为肉类食物）而引起，潜伏期大约10 h，临床表现为腹痛、腹胀、水样腹泻，无热、无恶心呕吐现象，1~2 d可自愈，如不进行细菌学检查常难确诊。针对产气荚膜梭菌的致病性GB 8537-2018《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水》微生物限度规定n=5，c=0，m=0 CFU/50 mL，即抽样5份，检验5份，作者简介：黄薇臻（1993—），女，本科，助理工程师；研究方向为微生物检验、微生物学。XIANDAISHIPIN现代食品/191Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析检测Analysis and Testing不得检出。根据平常监督抽检和风险监测检验，检出率很低，并且这是计数定量类型检验，所以很难发现GB 8538-2016检验方法实验过程中的问题。参加了中国检科院测试评价中心（ACAS）组织的矿泉水中产气荚膜梭菌的检测能力验证，并且同时进行阳性菌验证，发现在实验过程中，阳性菌和能力验证样品在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）均不显黑色，但GB 8538-2016规定挑取SPS平板上过滤法过滤水样后生长的可疑黑色菌落3～5个，分别接种FT培养基进行后续确证性实验。所以产气荚膜梭菌在SPS平板上不显现黑色，则会被定义为非疑似菌落，会导致漏检，不能真实反映样品中产气荚膜梭菌的存在情况。并且确认性实验中，GB 8538-2016规定取生长旺盛的FT培养液1 mL接种于含铁牛乳培养基，在46 ℃水浴中培养2 h后观察有无“暴烈发酵”现象发生，在5 h内不发酵者为阴性。经过实际试验，发现即使阳性菌也不能5 h内产生“暴烈发酵”现象，以此为根据很容易出假阴性实验结果。为解决这些问题，本文对标准中的检验方法进行了研究与改进。1.2 试验方法1.2.1 能力验证样品按GB 8538-2016试验按能力验证样品说明复原520 mL水样，等同于一个完整待测矿泉水水样。按GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》用0.1%蛋白胨水稀释4个稀释级，在用孔径0.22 μm的滤膜过滤，然后将滤膜移至SPS琼脂培养基平板上，倒置于36 ℃厌氧培养24 h观察结果。1.2.2 产气荚膜梭菌阳性菌模拟样品GB 8538-2016试验阳性菌产气荚膜梭菌复苏后直接吸取含菌复苏液1 mL加入520 mL灭菌水模拟含菌样品，等同于一个完整待测矿泉水样。按GB 8538-2016用0.1%蛋白胨水稀释7个稀释级，在用孔径0.22 μm的滤膜过滤，然后将滤膜移至SPS琼脂培养基平板和TSC琼脂平板上，并在滤膜上铺一层相同于底层的培养基均匀覆盖整个表面，倒置于36 ℃厌氧培养24 h观察结果。1.2.3 测量审核样品按GB 8538-2016试验按能力验证样品说明复原520 mL水样，等同于一个完整待测矿泉水水样。按GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》用0.1%蛋白胨水稀释4个稀释级，在用孔径0.22 μm的滤膜过滤，然后将滤膜移至SPS琼脂和培养基平板和TSC琼脂平板上[2]，并在滤膜上铺一层相同于底层的培养基均匀覆盖整个表面，倒置于36 ℃厌氧培养24 h观察结果。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种产气荚膜梭菌菌种，编号：ATCC 13124。经复苏纯化后，VITEK鉴定为产气荚膜梭菌阳性菌株。1.1.2 能力验证样品总编号：ACAS-PT738，分为两个样品：19-K292（有100稀释级以内的菌落）、19-G591（有100～200稀释级以内菌落）。1.1.3 测量审核样品总编号：ACAS-MA20，分为两个样品：MA20-A522、 MA20-A8431.1.4 主要仪器高压灭菌锅（型号：YXQ-LS-75G，上海博迅）；生物安全柜（型号：AC2-6S1，新加坡艺思高）；培养箱（型号：BSP-250，上海博迅）。1.1.5 主要试剂耗材亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂、2液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力-盐培养基、BHI培养液、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、盐还原试剂、乳糖-明胶培养基、0.1% 蛋白胨水。192/现代食品XIANDAISHIPIN2 结果与分析2.1 能力验证样品按GB 8538-2016试验结果分析由图1知，在4个稀释级中，均无发现黑色菌落，与检验依据标准中“产气荚膜梭菌在SPS琼脂上显黑色[1]”不一致，在平板上，肉眼可见仅有灰白色大颗菌落和黄色小颗菌落。同时用阳性菌产气荚膜梭菌画线SPS琼脂平板，也均无黑色菌落（见图2）。再次复试实验，同时也用GB 47.13-2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》中使用的TSC平板进行试验，因实验原液放入冰箱4 ℃保存，已经检测不出菌落，查询资料产气荚膜梭菌是厌氧噬热菌，放入冰箱冻存极有可能已经失活。所以如果按照GB 8538-2016实验，在此步骤中，即使样品中含有产气荚膜梭菌，实际按照此方法试验不出黑色菌落，则会被定义为非疑似菌落而不继续进行鉴定，最后产生假阴性结果。Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.󰀡Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测2支含铁牛乳培养基、黑色菌落目标菌插入底部接种 5支、表面接种5支，产气荚膜梭菌阳性对照菌底部接种5支，表面接种5支观察实验结果，在水浴培养5 h仍没有任何一支含铁牛乳培养基产生“暴烈发酵”的现象，只能继续水浴培养18 h，结果为：含铁牛乳培养基接种杂菌的2支均无现象；目标菌落表面接种的5支中3支产生“暴烈发酵”现象，插入底部接种的5支均产生了“暴烈发酵”的现象；产气荚膜梭菌图1 肉眼见灰白色大颗菌落和黄色小颗菌落图阳性菌表面接种的5支中4支产生“暴烈发酵”现象，插入底部接种的5支均产生了“暴烈发酵”的现象。水浴培养到24 h，结果并没有变化，继续培养到48 h，结果仍然没有变化。经过实验证明，含铁牛乳“暴烈发酵”实验如果按国家标准的要求46 ℃水浴培养， 5 h内不发酵为阴性，则会产生因阳性菌活力不足不能使含铁牛乳“暴烈发酵”报告假阴性结果，所以应对GB 8538-2016进行改进：取接种过黑色菌落生长旺盛的FT插入底部接种含铁牛乳培养基，在46 ℃水浴中培养18 h后观察有无“暴烈发酵”现象发生，在24 h图2 肉眼灰色透明菌落图内不发酵者为阴性。2.2 产气荚膜梭菌阳性菌模拟样品GB 8538-2016试验结果分析由图3知，结果发现各稀释级均能产生出黑色菌落，无灰白色菌落产生，除了浓度较高在滤膜上黑色菌落叠加而边缘模糊。挑取黑色菌落进行产气荚膜梭菌生化鉴定，阳性菌产气荚膜梭菌也接种FT培养基作为阳性对照，经试验所有生化鉴定均符合产气荚膜梭菌生化反应除牛奶发酵实验，按GB 8538-2016要求“取接种过黑色菌落生长旺盛的FT接种于含铁牛乳培养基，在46 ℃水浴中培养2 h后观察有无“暴烈发酵”现象发生，在5 h内不发酵者为阴性”，试验结果不管是目标菌还是阳性菌并不能在规定的5 h内有“暴烈发酵”的现象，分析可能原因为直接接种进含铁牛乳培养基试管，菌液在上表面，而产气荚膜梭菌为厌氧菌，菌液在表面与空气接触会影响牛奶发酵实验。再次进行实验，把菌液通过移液管插入生长旺盛的FT底部接种，这样可以排除空气接触的影响，经过试验结果还是不管是目标菌还是阳性菌并不能在规定的5 h 内有“暴烈发酵”的现象，分析原因可能是目标菌即使在FT中经过24 h培养活力仍然不足以是含铁牛乳在5 h内“暴烈发酵”，标准中可能对牛奶发酵实验的时间要求过于苛刻。为了证明此观点，进行实验验证，用能力验证中的杂菌（非产气荚膜梭菌）接种 图3 各稀释级均能长出黑色菌落图2.3 测量审核样品按GB 8538-2016试验结果分析由图4知，试验结果因为覆盖了表面已经均能生长黑色菌落，无灰白色菌落产生，但在SPS琼脂平板的滤膜上，菌落灰黑色，菌落整颗比较小且边缘模糊并且有菌落连片生长黏连一起，只有计数两个1∶10稀释度的SPS平板分别为10和15（见图5、6），而在TSC琼脂平板菌落呈炭黑色，菌落边缘清晰整齐，分布较均匀在滤膜上，计数两个1∶10稀释度的TSC平板分别为11和12（见图7、8）。按GB 8538-2016要求挑取黑色菌落进行产气荚膜梭菌生化鉴定，SPS平板滤膜上的菌落比较模糊，黏连一片比较难挑取，而TSC平板滤膜上菌落清晰，扁圆状贴在滤膜和覆盖的培养基之间，容易挑取，甚至可以整颗挑出。同时挑取SPS平板上和TSC平板的黑色菌落进行产XIANDAISHIPIN现代食品/193Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析检测Analysis and Testing气荚膜梭菌生化鉴定，阳性菌产气荚膜梭菌也接种FT培养基作为阳性对照，经试验所有生化鉴定均符合产气荚膜梭菌生化反应，按“插入底部接种含铁牛乳，水浴培养18 h”的改进方式进行含铁牛乳“暴烈发酵”实验，挑取SPS平板和TSC平板上的黑色菌落各 10颗，阳性菌产气荚膜梭菌平行接种做对照，结果TSC平板黑色菌落接种的含铁牛乳产生“暴烈发酵”有9支（见图9），SPS平板黑色菌落接种的有6支（见图10）。通过实验对比发现相较于GB 8538-2016推荐使用的SPS培养基，GB 47.13-2012中计数使用的TSC培养基对矿泉水中产气荚膜梭菌在滤膜上显现黑色更具有明显性和特异性。SPS培养基的原理在于产气荚膜梭菌具有还原亚硫酸盐的能力，把SPS培养基中的亚硫酸盐还原为硫化物，再与柠檬酸铁铵反应产生黑色沉淀，使菌落呈黑色[3]。而TSC培养基是 D-环丝氨酸（400 mg·L-1）作为筛选剂。焦亚硫酸钠和柠檬酸亚铁铵是亚硫酸还原（H2S生成）指示剂，产气荚膜梭状芽胞杆菌能够还原亚硫酸盐，菌落变黑。卵黄乳液的引入是为了检测该菌的卵磷脂酶活性，同时也促进产气荚膜梭菌的生长，但在计数时不添加卵黄乳液效果会更好。相对于SPS培养基，TSC培养基对于产气荚膜梭菌的生长性更有利，所以在检验方法是过滤法的情况下，水样过滤0.22 mm滤膜，肯定会产生菌体的损害和菌的量的损失，所以TSC培养基相对SPS培养基水样过滤培养后菌落更加清晰，显现黑色更加明显。并且经过长时间的培养基保存观察，相对于SPS培养基，TSC培养基在同等条件下更为稳定，不容易结块，其原因在于SPS使用的是酵母浸膏，而TSC使用的是酵母粉，酵母浸膏粘度更大相对更容易结块。图9 TSC牛奶发酵实验结果图 图7 TSC平板计数图 图8 TSC平板计数图 图5 SPS平板计数图 图6 SPS平板计数图图10 SPS牛奶发酵实验结果图3 结论按GB 8538-2016现在的方法进行产气荚膜梭菌检验，即使有产气荚膜梭菌的存在，也因按国家标准方法检验现象不明显而检测不出实际的结果。产气荚膜梭菌在厌氧条件下可以分解蛋白质产生氨、硫化氢等化合物，可以还原亚硫酸盐为硫化物，硫化物柠檬酸图4 SPS和TSC均能长出黑色菌落图铁铵反应成硫化铁产生黑色沉淀，使菌落呈黑色[4]。194/现代食品XIANDAISHIPINCopyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.󰀡铁离子吸收主要是通过铁离子与微生物菌体直接接触将铁离子传入细胞内，滤膜过滤后贴在培养基上在覆盖一层培养基才能增加铁离子和微生物菌体的接触，并且提供更好的厌氧环境，对GB 8538-2016的改进滤膜法应贴膜后表面在覆盖一层培养基。相对SPS培养，TSC更适合产气荚膜梭菌的生长和表现性状，并且TSC培养基相对于SPS培养基保存更具有稳定性，所以对GB 8538-2016的改进推荐使用TSC培养基替换掉SPS培养基。GB 8538-2016中牛奶发酵实验为了保证更好的厌氧环境，应把培养的产气荚膜梭菌的生长旺盛的FT培养基插入底部接种含铁牛乳培养基，且水浴培养时间应延长到18 h，培养到24 h不发酵再定义为阴性。参考文献：Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测[1]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 8538-2016 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法[S].北京：中国标准出版社，2016.[2]中华人民共和国卫生部.GB 47.13-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验[S].北京：中国标准出版社，2012.[3]潘宝怡，吴清平，彭飞艇，等.饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进[J].现代食品科技，2012，28（9）：1236-1238，1265.[4]李金霞，程 池，郭立芸.饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测方法改良[J].中国卫生检验杂志，2010，20（8）：2079.（上接第181页）[6]贺 峦.液质联用技术（LC-MS）在中药成分分析中的应用[J].科技风，2016（19）：188.[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 21323-2007 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法[S].北京：中国标准出版社，2008.[8]飞，陶蓓蓓，张绪得，等.高效液相色谱-串联质谱法测定人体内30种氨基酸[J].分析化学，2013，41（9）：1347-1352.[9]Kawano S I.Analysis of impurities in streptomycin and dihydrostreptomycin by hydrophilic interaction chromatography/electrospray ionization quadrupole ion trap/time - of - flight mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry，2009，23（6）：907-914.[10]Tao Y，Chen D，Yu H，et al.Simultaneous determination of 15 aminoglycoside (s) residues in animal derived foods by automated solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Food chemistry，2012，135（2）：676-683.[11]Alpert A J.Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds[J].Journal of chromatography A，1990，499（2）：177-196.[12]徐 飞.氨基糖苷类药物残留检测筛选和确证方法的研究[D].北京：中国农业大学，2014.春种一粒粟，秋收万颗子。XIANDAISHIPIN现代食品/195Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. 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