CHO-k1细胞状态的检测

 玻片处理方式 用之前用多聚赖氨酸处理 滴片1小时 滴片24小时 滴片48小时 浸泡于多聚赖氨酸溶液中，用前用PBS洗 滴片1小时 滴片24小时 滴片48小时 消化20秒 量多，已贴壁 封接前：-5PA 封接后：-60pA (-70mV) WC:-80pA 2 cells same 封接前： -5PA 封接后：-80pA(-70mV)-110pA(-140mV) WC:-100pA; 封接前：-10pA 封接后：-35pA(-70mV)-80pA(-140mV) WC:-40pA 封接前： 5pA 封接后：-1.64nA(-70mV) 反应为一个纯电阻 消化30秒 量多，已贴 壁 封接前：10PA 封接后：-70pA（-70mV） WC:-70pA 封接难度+1；吸破难度+1 消化40秒 玻片干掉了， 细胞不能用了 消化50秒 封接前：-1-1PA 封接后：-140pA(-70mV) WC:-140pA; 封接 量多，已贴壁 封接前：7-9PA 封接后：-50pA（-70mV） 封接难度+2；细胞易破；漏-900pA; 封接前：1-4PA 封接后： 前：5-7pA 封接后：-30pA(-70mV)-85pA(-140mV) WC:刚开始不太稳(-100~-140pA)记录一次后稳定在-40pA 封接难度+2 WC:-50pA 封接难度+1；吸破难度+2 -200pA(-70mV) WC:-200pA;细胞状态不好，在达到GO之前已破；不能坚持记录一个potocol; 封接前： 10pA 封接后：-10pA(-70mV) WC:-300pA;

多聚赖氨酸浓度：0.05mg/ml;0.025mg/ml Typsin 浓度：0.25%

转染条件优化 转染4小时 转染4.5小时 转染5小时 1.3*10^5 记录3个细胞， 1：-240 ~ -80 ~ -60pA,有 2：-1.5na;只有Q1表达； 3：-300pA;有 转染5.5小时 0.8*10^5 记录8个细胞，只有4个有表达 1：-20pA,有(2.5nA) 2：-40pA,有(6nA) 3：-50pA,有(1nA) 1.2*10^5; 0.9*10^5 转染后24小时 记录8个细胞，记录3个细胞， 只有4个有表达 1：-1.1nA 1：-2nA,无 2：-300~400pa;难2：-200pa;无；状吸破 态不稳定 3：-100pA;有 3：-100pA;无 4：-1.4nA；有 5：-4.7nA 6:-1.6nA;有 7：-500pA;有 8：-100~-400pA;有；状态不稳 转染后36小时 1:-100~-300pA,细胞有污染 转染后48小时 有(4.5nA) 2：-1.02nA,有 3：-70pA,有(1nA) 转染后60小时 细胞有污染 1：-400pA,有细胞状态不好 2：-1.3nA,封接过程中破掉了 3：-90pA,有Q1单独表达 4：-1.1nA;有 细胞有污染

每孔转染的细胞中加：Q1 -0.8ug; E1-0.8ug；EGFP-0.8ug;lipo-5ul

转染后每皿4片玻片：记录电流时间：24小时；36小时；48小时；60小时；

第二轮优化 转染后36h 转染后48h 转染后60h

转染4h，消化15s 转染4h，消化20s 转染后24h 转染5.5h，消化15s 1:-100p有(2nA) 2：-1.8nA,有 3:-150pA,有(1nA) 转染5.5h，消化20s 1:-160~-180pA,有(1.6nA) 2：-130pA,有(1nA) 3：-20pA,有(1.7nA) 转染后48h 转染后60h Q1+E1电生理实验步骤：

1.CHO-k1细胞传代（细胞密度>90%）：吸走原有培养基；用PBS洗一遍；加入1ml 0.25%胰酶()消化30s,吸走胰酶；加入2ml含血清的F12培养基吹打混匀细胞，加入1.5mlEP管中，1000RPM离心4分钟；弃上清，用800ul含血清的F12培养基重悬细胞；24孔板4个孔，每孔加70ul-80ul细胞悬浊液；其余加入60mm细胞培养皿中; 每孔400ul培养基；60mm

2.转染：细胞密度为70%转染（细胞铺底占培养皿底面70%）

（100ul无血清F12培养基+0.8ug*质粒数）/孔数，用枪吹打混匀，静置

（100ul无血清F12培养基+2ul lipo()/1ug 质粒）*孔数，用枪吹打混匀，静置 5分钟后，上述两者一起混匀，静置15-30分钟(勿动！)

3.在等待的过程中，取出放在酒精中的小玻片，在酒精灯上灼烧，去除多余的酒精，稍凉之后，放入已准备好待用的35mm细胞培养皿中；一个培养皿中放置3片玻片

4.滴加多聚赖氨酸于玻片表面，100ul多聚赖氨酸()/3片玻片；约2分钟后，吸走多余的多聚赖氨酸，置超净台中待用

5.质粒和lipo的混合液放置约25分钟后，吸走24孔板中原有培养基，加入200ul无血清F12培养基；把上述质粒和lipo的混合液均匀滴加入孔中，混匀（稍微晃动）后放入培养箱

6.5.5小时后，吸走含有lipo的培养基，每孔加入200ul的0.25%胰酶消化20s，吸走胰酶，加入400ul含血清的F12完全培养基吹打细胞20次，尽量把细胞都脱离孔板底部并吹匀

7.把细胞悬浊液滴在玻片上，200ul/3片玻片；放入培养箱中培养

8. 1小时后，在装载玻片的培养皿中补加含血清的F12完全培养基1.5mL（不要对着玻片吹），放回培养箱中培养待用

9. 24小时之后，取出一片玻片做电生理实验。