重组人脂蛋白相关磷脂酶a2的原核表达及单克隆抗体制备

·2703·

论著·基础研究

重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及单克隆抗体制备

(山东莱博生物科技有限公司,山东济南2山东省体外诊断用免疫原料制备与标记1.50100;2.

22

,,欧兰香1,陈 振1,王佳颖1,解光宁1,王 岩1,朱之炜1△

()目的 构建重组人脂蛋白相关磷脂酶A的原核表达质粒,制备重组人L并通 摘 要:2L-PLA2-PLA2,pp

过免疫诱导获得人L通过P-PLA2的单克隆抗体。方法 以人cDNA文库为模板,CR的方法获得PLA2G7p(。通基因的编码区序列,并与原核表达载体p构建原核表达质粒,转化大肠杆菌RET32a进行连接,osttaDE3)/过在3条件下诱导蛋白表达,经过纯化获得重组人L免0℃0.2mmolL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)-PLA2;p

)工程技术研究中心,山东济南250100

/疫B制备单克隆抗体;并通过酶联免疫吸附试验法测定效价,检测抗体特异性。结果 通过Nalbc小鼠,otⅠ

3和S经纯化得到4与LalⅠ双酶切及测序证实原核表达质粒构建成功;7×10左右的蛋白,-PLA2抗体进行蛋p6

与纤维蛋白原、反应蛋白无交叉反应。结论 成功获得重组人L并制备得到了效价较高的2×10,C--PLA2,p

单克隆抗体,为后续L-PLA2检测试剂盒的开发奠定了基础。p

白免疫印迹法杂交呈阳性,表明已得到重组人L最终获得单克隆抗体,效价为1∶-PLA2。通过对小鼠免疫,p

关键词:脂蛋白磷脂酶A2; 原核表达; 单克隆抗体

:/中图法分类号:DOI10.3969.issn.1673-4130.2019.22.004Q556,R446.1j()文章编号:1673-4130201922-2703-05

文献标识码:A

hosholiaseA2andprearationofmonoclonalantibodiespppp

,111211△

OULanxianCHENZhen,WANGJiainXIEGuanninWANGYan,ZHUZhiweig,yg,gg,(,,1.ShandoneiboBiotechnoloo.Ltd.Jinan,Shandon50100,China;2.ShandonrovincialgLgyCg2gPProkaroticexressionofrecombinanthumanliorotein-associatedyppp

1,2

mice.ThetiterandthesecificitftheantiboderedeterminedbLISA.Results Theplasmidwasiden-pyoywyEtifiedbhedouble-enzmediestion(NotⅠandSalⅠ)andseuencin.Thepurifiedproteinwasabout47×ytygqg

combinanthumanL-PLA2waspurifiedbinducinheexressionoftheproteinundertheconditionof0.2pygtp

//mmolLisorolalactoside(IPTG)at30℃.ThemonoclonalantibodasprearedbimmunizinalbcppygywpygB

uenceofPLA2G7genewasobtainedbCRandlinkedwithprokaroticexressionvectorET32a.Thepro-qyPypp

)karoticexressionplasmidwasconstructedandthentransformedintoEscherichiacoliRostta(DE3.There-yp

:AbstractObective Toconstructaprokaroticexressionplasmidofhumanliorotein-associatedphos-ypppj

,holiaseA2(L-PLA2)rearerecombinanthumanL-PLA2,andobtainmonoclonalantibodiesaainstppppppg

,humanL-PLA2bimmunoinduction.Methods HumancDNAlibrarasusedastemlatethecodine-pyywpgs

EnineerinndTechnoloesearchCenterorPrearationandMarkinmmuneggagyRfpgofIRawMaterialsorinVitroDianosis,Jinan,Shandon50100,China)fgg2

10insize.TheproteinshowedapositiveresultintheWesternblothbridizationwiththecommercializedL-yp,,PLA2antibodindicatinhattherecombinantL-PLA2hasbeenachieved.BimmunizinthemicetheL-ygtpygp

3

erssuchasfibrinoenorC-reactiveprotein.Conclusion HumanrecombinantL-PLA2wassuccessfullb-gpyo

,tainedandmonoclonalantibodieswithhihtiterwereprearedwhichlaidafoundationforthedevelomentofgpp

PLA2monoclonalantibodieswasachievedwithatiterat1∶2×10,andnocross-reactionwithotherbiomark-6

subseuentL-PLA2detectionkit.qp

:;Keordsliorotein-associatedphosholiaseA2; prokaroticexression monoclonalantibodiesppppypyw

(是近年来一种被广 脂蛋白磷脂酶A2L-PLA2)p

泛关注的新型炎症标志物。L-PLA2蛋白包含441p

3[1]

个氨基酸,相对分子质量为4由P5.5×10,LA2G7

]2

,基因编码[该基因由1位于人类62个外显子组成,

:作者简介:欧兰香,女,研究员,主要从事医学诊断研究。 △ 通信作者,E-maillabresearcher@126.com。2703-2707.

]:本文引用格式:欧兰香,陈振,王佳颖,等.重组人脂蛋白相关磷脂酶A国际检验医学杂志,2的原核表达及单克隆抗体制备[J.2019,40(22)

·2704·

,,,国际检验医学杂志2019年11月第40卷第22期 IntJLabMedNovember2019Vol.40No.22

号染色体的612-21.1区段。L-PLA2是一类不依ppp赖于钙离子的磷脂酶,能够降解氧化磷脂,并将它们降解为溶血磷脂及氧化游离脂肪酸等。这些降解产物会刺激机体分泌细胞因子和黏附因子,进而导致血检测血液中的L能够帮助预测冠心病-PLA2水平,p原核表达载体,通过诱导、纯化获得人L-PLA2重组p蛋白,并通过重组抗原免疫得到L-PLA2的单克隆p抗体,为后续L-PLA2免疫检测试剂盒的开发奠定p基础。现报道如下。3-4]

,管内皮功能异常[最终形成早期动脉硬化斑块。]5-6

。本研究通过构建L或缺血性卒中的发生[-PLA2p

(进行双酶切,回收目的基因片段与原核表达载体+)

片段,按照摩尔比3∶1的比例进行混合,16℃连接

转化大肠杆菌DH将菌液涂布于3h,5α感受态细胞,

含有卡那霉素的LB固体培养基上,37℃培养过夜。挑取单克隆,扩大培养后提取质粒,进行PCR和酶切鉴定,阳性克隆送济南博尚生物有限公司进行测序鉴

()定。提取质粒后,再转化大肠杆菌R感受osettaDE3态细胞。

1.2.3 重组人L-PLA2蛋白的表达 将保存于p

接种于-80℃的pET32a(+)-PLA2G7菌液取出,

LB培养基中,37℃培养过夜。按照万分之一的比例

材料与方法.1 材料

.1.1.H15.2α、 质粒、 Ro主要试剂setta(菌株DE 3) 人单核细胞菌株由本实验室保存质粒pET32a(+)

、(。大肠杆菌;pEASYT-HP-1)cDNA表达文库为本实验室前期构建Ⅰ,DNq酶,A凝胶回DN收A连接酶,PTri1mCeloSniTnAg自北京全式金生物技术有限公司,试剂盒购自大连宝生物工otRK

i高保

t购真TaT4限制性内切酶N程Ⅰ有、Sa限

l公司;弗氏完全佐剂与不完全弗氏佐剂、降植烷、

EG4000、HAT条件培养基购自Sima公司;Protein购自美国盒购自洛阳佰奥通实验材料中心GE公司;小鼠单抗Igg

类/亚类鉴定试剂

;酶标板购自厦门云鹏科技发展有限公司。

.1.3 实验动物 Balb/c小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。.2 方法

.2.1 Lp

-NPCLA2基因的获得 在美国国立生物技术信息中心(性B引I)物上检索得到人在上、下游两L端-分PL别A2基因序列,并设计特异p添加alⅠ酶切位点,引物序列见表,对PLA2G7基因进行1扩。增以人类。反应cD程NN序Aot文库Ⅰ、为模板如下:

循环5℃;,75与2mp℃inEA5;95SmYi-n℃T。601通过电泳s,55℃中间载体进行连,4回收0s,712接27℃,580s,35个

转bp的目的片段化大肠杆菌DH5α感受态细胞,

将菌液涂布于含有卡那霉素的B固体培养基上,37℃培养过夜。挑取单克隆,

扩大培养后提取质粒,进行PCR和酶切鉴定,将筛选得到的阳性克隆送济南博尚生物有限公司进行测序。

表1 PLA2G7基因扩增引物序列

引物名称

引物序列(AT5'-3')LA2G7上游GAACTAGGLA2G7下游

TGACCGAAAATGCTAATCCGGCCGCTT

引物大小(bp

)33TAGTTA

CATCAGCTGTCC

ATTTCT

28

.2.2ot 原核表达质粒Ⅰ、SalⅠ分别对ppEETA3S2-YP-LPLA2A2G7的构建G7与pET 使

用N32a将菌液集中于诱导培养基(母提取物22g,甘油4mL,卡那霉素NaCl9g0,蛋白胨.137℃培养3h,至吸光度mg/1m1Lg

),中酵,IP(ATG)6)0诱导蛋白表达0在0.5~0.8,时,

加入异丙基硫代半乳糖苷(30续高速振荡培养菌体,经超声破碎后再离心7h。5000,r分离获得上清液/min离心10m℃继

,in收集

十二烷

基硫酸钠白表达情况-聚丙烯酰胺凝胶电泳(。

SDS-PAGE)

检测蛋1.2.4 重组人镍柱层析法对含Lp-PLA2的纯化和鉴定有化。洗脱缓冲液:Lp

T-rPisL 使用亲和A22的上清液进行初步纯0mmolL,NaCl/10mm进行.6o%l/LNaW,C/咪lV梯,唑p

度H50洗80脱.5mm,。收初ol/L,甘油10%,CHAP00

S

集纯洗液脱通组过分经,再GE经-D过EAE柱柱进行脱盐,收集洗脱组分。将得到的重组蛋白进行

P-6DG

SDS-PA通过半干法将蛋白转移到硝酸纤维;5GE电泳,

素膜上%脱脂奶粉室温封闭与兔抗人3PLA2抗体(1∶1500倍稀释)进3h后;行杂交,28℃孵Lp

育

-酶标记的羊抗h;

取出硝酸纤兔维h;Ig

素G(膜1∶,漂50洗00后倍,加稀入释辣),根室过温氧孵化育物1.2漂洗后使用.5 LECL进行显色。

1Lp-PLA2单克隆抗体的制备重组人-PLA2与等体积的完全弗 将制备得到的氏佐剂合,对Baplb/充分混c小鼠进行皮下多点注射(原/只)4周后测定血清效价,选择免疫反5应0好μg抗

。的个

体加强免疫,将抗原与不完全弗氏佐剂充分混合后,通过皮下多点注射(25,细胞融合前连续μ加g抗原/只)

,连续进行免疫强免疫6次再p

20骨髓瘤细胞进行融合2次;之后取脾细胞

与S/养行酶联免疫吸附试验9~11d

,待培养孔中生长出较大的细胞克隆后。融合细胞在37℃(有限稀释后,进行ELISA)筛选;将阳性克隆进行,培进存细胞。按照

04次克隆化培养,保腔内接种杂交瘤细胞.5mL/只的剂量使用(2降×1植06

烷细胞处理/小只鼠),,饲养1周后在腹

1酸铵沉淀后,使用行亲和纯化。

Protein0Ad后

收集腹水。腹水经硫进

1.2.6 重组人L-PLA2单抗隆抗体的鉴定9.6的碳酸盐缓冲液将重组人p

Lp

-PLA2稀释到 用0p.2H5111D1PA111S9LPP1,,,国际检验医学杂志2019年11月第40卷第22期 IntJLabMedNovember2019Vol.40No.22

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/包被酶标板,mL,4℃过夜。第2天取出酶标板,gμ

按照小鼠单抗I对g类/亚类鉴定试剂盒说明书流程,纯化得到的不同单克隆抗体进行亚类鉴定。为了挑选包被抗体和检测抗体的最佳组合,将不同单克隆抗

体分别包被酶标板和酶(标记,进行两两配对的HRP)

筛选最佳抗体组合。用稀释液将纯化后ELISA检测,

中稳定表达,能够用于后续实验。将纯化后的重组人

通过半L-PLA2通过SDS-PAGE电泳将蛋白分离,p

干法转印至硝酸纤维素膜上,与商业化的L-PLA2p

3

抗体杂交,显色后在4见7×10处出现特异性条带,图4,这表明纯化后的重组人L-PLA2具有较好的免p疫学活性。

9.6的碳酸盐缓冲液将人L-PLA2单克隆抗体稀释,p包被酶标板,4℃过夜。第2天取出酶标板,TSBT洗涤1次,每孔分别加入纯5%BSA溶液37℃封闭2h;

的抗体进行倍比稀释,通过ELISA法检测抗体效价,对照为10000倍稀释后的小鼠免疫前血清。用pH

化后的洗涤7L℃-P孵育LA2及纤维蛋白酶原的标准品,3p1h。C孵育完成后取出酶标板反应蛋白、,TBST

隆抗3次,分别加入标记了体100μL(1∶4000H稀RP的人释),37Lp

℃-P孵LA育2单克1BST洗涤5次,加入h。

取出后加终止液,在酶标仪上测定TMB底物,3A7。。

4℃显色50读数2,0分析所min制备的单克隆抗体的特异性.3 统计学处理 本研究所有统计学分析均使用

计量资料以x±两用PtSS检验17.0进行,s表示,

两比较采,以P<0.05为差异有统计学意义。 结.1 果原核表达质粒的鉴定 以人THP-1c段,见图1。与pEASY-T1连接后送公司进7D基因片

NA文库为模板,利用特异性引物扩增得到PLA2G行测序;确定片段正确后,用于构建NotⅠ、SalⅠ对已构建的pET32a重(+组)-质PL粒A2G7质粒。使用pLA的目2G7电泳后分离得到pET32-的序列片段,

见图5无碱基突变,与NCBI已公2.4kb的载体片段及1257

布。的经基测因序编,P码LA序2G列7片段一致,

说明载体构建成功,可用于后续实验。 注:M表示DL2000DNA图1 PLA2mGar7ke基因r

PCR扩增图

.2 重组人纯化与鉴定件摸索,在本研究中Lp

-PLA,2的表达、重组 经过条下:mm37℃培养条件下,A600L为p-PL0

.5A~2优化表达体系如0.8时,加入0.2够在ol本一致AGED/L的EIPTG,30℃培养7h,重组人Lp

-PLA2能电泳检测3中以可溶蛋白的形式大量表达。经,重组蛋白约为,蛋白在上清中表达量最4高7×,占103

菌,

体与理论值基SDS-总蛋白的

0%左右,

见图3。这表明重组蛋白能够在大肠杆菌 注:M表示DL2000DNAPLA2G7质粒Nmarker;1~2表示pET32a(+)-图ot2Ⅰ与 SpalEⅠ双酶切产物

T32-PLA2G7酶切电泳图

注:表示A图中M表示蛋白分子量标准,1表示未经IPTG诱导菌液,,,;2

分子量标准IPTG诱导后的菌液表示沉淀表示上清图中表示蛋白,L图p-34BM3P LA2表示纯化后的重组人重组人Lp

-PLA2的表达和纯化Lp

-PLA2图4 重组人Lp

-PLA2的蛋白免疫印迹检测T1S22Pb25P·2706·

,,,国际检验医学杂志2019年11月第40卷第22期 IntJLabMedNovember2019Vol.40No.22

2.3 重组人L-PLA2单克隆抗体的鉴定 经过一p系列筛选,共得到5株单克隆抗体(1D7、2A3、2E6、,经过蛋白免疫印迹验证,它们都能特5F1和6H12)异性识别L见图5。使用抗体分型试剂-PLA2蛋白,p轻链为κ链,5F1和6H12为IG2b亚型,2A3为g

轻链为λ链。对5株抗体进行两两配对IG2a亚型,g

的双抗体夹心E使用2LISA检测分析显示,E6作为包被抗体、具有较高的检测灵敏5F1为检测抗体时,度,见表2。通过间接E本实验所制备LISA法检测,得到的L见-PLA2抗体效价可达1∶2×10以上,p

6

蛋白原、反应蛋白进行E发现抗体不会C-LISA检测,与纤维蛋白原、反应蛋白等发生交叉反应,具有较C-好的特异性,见图7。

Coating抗体1D72E65F12A3

盒对所述单克隆抗体进行亚型鉴定,其中1D7、2E6、

表2 单克隆抗体的配对筛选

1D70.4120.1431.2460.967—

2A3

Cature抗体p

0.9760.721

—1.6230.5132E6

5F1

6H12

0.879

—1.2130.6990.738

1.0391.0122.471

—0.799

0.3170.2630.1150.567

—

6H12

图6。将该抗体包被酶标板,对L纤维-PLA2蛋白、p

—表示未进行此组检测 注:

(空白质粒阴性对照 注:M表示蛋白分子量标准;-表示:ET32a+)p

图5 L-PLA2单克隆抗体的蛋白免疫印迹检测p

3 讨 论

心血管疾病是一种在全球范围内危及人类生命安全的疾病,其发生、发展与动脉硬化的产生具有密不可分的关系,而L-PLA2在动脉硬化斑块形成过p

7-9]

。在体内,程中又发挥了重要作用[L-PLA2与高p[10]

密度脂蛋白和载脂蛋白A1呈负相关。L-PLA2p能够水解磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等甘油酸脂的

[11]

产生游离型氧化脂肪酸和溶血卵磷sn-2位磷脂键,

脂。因此,又被称为血小板活化因子乙酰水解酶[12](PAF-AH)。L-PLA2的水解产物很多都能够刺p激炎性因子,如细胞黏附因子、细胞因子等的产生,引

图6 L-PLA2抗体效价分析p

发血管内皮损伤,使得黏附在内皮细胞上的单核细胞数量增加,血管内皮通透性改变,当单核细胞通过受损内皮进入血管内膜后,会形成巨噬细胞并吞噬氧化型低密度脂蛋白,产生动脉粥样硬化斑块;巨噬细胞分泌的炎性因子也会加速动脉硬化斑块的形成。2005年美国食品药品管理局已批准将L-PLA2作为p

]5

。动脉硬化和缺血性卒中的风险评价因素[

图7 L-PLA2单克隆抗体与其他心血管p

标志物的交叉反应性

物(如大肠杆菌、昆虫、酵母)中进行过L-PLA2的表p

]13

。在本达研究,但存在不表达或表达量较低的情况[

目前,已有课题组利用DNA重组技术在不同生

研究的前期实验过程中发现L-PLA2主要以包涵体p

,,,国际检验医学杂志2019年11月第40卷第22期 IntJLabMedNovember2019Vol.40No.22

·2707·

(和便于蛋白生产、纯化的双融合伴侣原核表达trxA)

[]14

载体p从而增加重组LET32a,-PLA2的可溶性。p使用相对较低的温度(诱导蛋白表达,并在培养30℃)

的形式被分泌出来。通过使用含有硫氧还蛋白

[]Š,8TEFANICP,KOPOLOVETSIHERTELYOVÁZ,et

al.LioroteinassociatedphosholiaseA2asamarkerpppp

/基中适当提高抗菌药物水平(0.1mmL的卡那霉g

4 结 论

本研究获得大量高纯度的人L-PLA2重组蛋p白,并通过该蛋白免疫得到对应的具有高特异性的单克隆抗体,为后续L-PLA2检测试剂盒的开发奠定p了基础。参考文献

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