1.3.3 IHC方法(1)采集叶片和嫩芽：将叶片切成方形（0.5 cm），嫩芽保持原形，放入固定液中，抽气，固定过夜，DEPC水洗1 h。 (2)脱水、透明： 30%ethanol：1 h；50%ethanol：1 h；75%ethanol：1 h；85%ethanol：1 h；95%ethanol：1 h；100%ethanol：2×30 min；3：1（absolute ethanol：Xylene）1 h；1：1（absolute ethanol：Xylene）1 h；1：3（absolute ethanol：Xylene）1 h；xylene：2 ×30 min。(3)浸蜡：将蜡块切成碎片，装入输液小瓶中，烘箱调至40℃，至液面出现一薄层蜡为止，打开瓶盖，使二甲苯挥发。一般2～3天。(4)纯蜡：倒入融化好的过滤后的纯蜡，60℃烘箱放置。(5)包埋：将60℃烘箱放置的纯蜡倒入自制的方盒中（牛皮纸），将样品均匀摆放，迅速放入冰盒中，后4℃冰箱保存。(6)蜡块制作：切片、贴片（载玻片一定清洗干净，否则容易脱片。用玻璃清洗剂浸泡过夜，后蒸馏水冲洗，用纯棉布擦干或烘干，不可晾干） 粘贴时，用玻璃棒蘸少许粘贴剂加在载玻片上，涂抹均匀，使之成为几乎看不见的很薄的一层。加少许蒸馏水作为浮载剂，将蜡带浮在上面，光的一面向下。微微加热(不超过43 ℃)，使石蜡带展开而平铺在载玻片上，吸去多余的蒸馏水，用针将石蜡膜移在适当的部位。温度不要过高或过低。过低，石蜡膜展布不好；过高，石蜡熔化，也不利于展布。在室温下干燥数日后，即可脱蜡染色。(7)脱蜡、水化： 烘箱中60℃×20 min→xylene：2 ×10 min；100% absolute ethanol：2 ×5 min；95% ethanol：2 min；80% ethanol：2 min；70% ethanol：2 min；distilled water：5 min；PBS洗3次×3 min。(8)细胞通透、封闭内源性过氧化物酶1)用封闭通透液浸润切片30 min（RT避光）；2) PBS溶液洗3次×3 min。(9)封闭非特异性蛋白1) PBS溶液洗3次×3min；2)将切片取出,周围水分用滤纸吸干，用组化笔在组织周围画上圈，在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中，室温30min。(10)一抗孵育甩去切片上的羊血清，用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：400）后，放入湿盒中4℃过夜，从冰箱中取出需37℃复温45 min。(11)二抗孵育 1)将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗（1：700）后室温孵育1h；3)用PBS洗5次×5 min。(12)显色加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）。(13)复染、脱水、透明、封片1)用PBS 3次×3min后，用双蒸水洗5 min；2)将切片放入苏木精染液中，
复染3min左右，双蒸水洗5 min，（再用PBS返蓝5 min，此步影响不大）；3)脱水： 50% ethanol：1-2 min；70% ethanol：1-2 min；95% ethanol：1-2 min；95% ethanol：1-2 min；100% absolute ethanol:：(1-2) min；100% absolute ethanol：(1-2) min。4)透明：xylene1×(1-2) min→xylene 2×(1-2) min5)封片：中性树胶。切片观察，记录与拍照。在10×40倍显微镜下观察每张切片，用OLYMPUS显微镜进行拍照。首先观察阴性对照（第一抗体和第二抗体均加PBS缓冲液）与阳性对照（ELISA结果中阳性明显的样品），阴性对照样品DAB显色后呈现蓝色反应，阳性对照DAB显色后有抗原的部位呈现棕色至棕黑色反应。把待检样品与阴性对照和阳性对照进行比对，不含SHMT的记为“―”， 含有SHMT的记为“＋”。