牡丹江医学院学报 ２０１３年 第３４卷 第６期 ・１・ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＵＤＡＮＪＩＡＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏ１．３４ ＮＯ．６ ２０１３ 宁夏滩羊ＫＡＰ１．１基因多态性及其与二毛裘皮重要性状关系的研究 贾 桦 杨丽娟 李爱华 张蕊 陈志强 何立荣 赵万余 银川 银川 ７５０００４； Ｉ （１．宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系 宁夏２．宁夏大学生命科学院；３．宁夏大学饲料工程技术研究中心 宁夏７５００２１） 【摘要】 目的：研究宁夏滩羊ＫＡＰ１．１基因的遗传多态性及其多态位点与滩羊二毛毛股弯曲数、纤维直径及毛股自然长度 的关系，寻找可用于辅助选择的分子标记，为下一步分子育种提供理论依据。方法：采用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ技术研究了２６１只滩羔 羊ＫＡＰ１．１基因的多态性，利用ＤＰＳ７．０５软件分析了２个多态位点不同基因型裘皮性状的最小二乘均值（ＬＳＭ），并进行了多 重比较。结果：发现ＫＡＰ１．１基因有两个突变位点ｓｌ和ｓ２，其中ｓ１位点有３个基因型，ｓ２位点有５个基因型。在二毛裘皮毛 股弯曲数性状上，ｓ１一从的ＬＳＭ高于Ｓ１一ＡＢ、Ｓ１一ＢＢ，但三种基因型阃无显著差异（Ｐ＞０．０５），Ｓ２一ＡＢ的ＬＳＭ高于ｓ２一 ＡＡ、ｓ２一ＢＢ、ｓ２一ＡＣ、ｓ２一ＤＤ，但五种基因型间无显著差异（Ｐ＞０．０５）；在毛股自然长度性状上，ｓ１一ＡＢ的ＬＳＭ显著高于ｓ１ ＢＢ（Ｐ＜０．０５），ｓ２一ＡＣ基因型的ＬＳＭ板显著高于ｓ２一ＢＢ（Ｐ＜０．Ｏ１）；在毛纤维细度性状上，Ｓ１一ＡＡ的ＬＳＭ低于Ｓ１一ＡＢ、 Ｓ１一ＢＢ，但三种基因型阃无显著差异（Ｐ＞０．０５）。结论：本研究发现了宁夏滩羊ＫＡＰ１．１基因的两个多肽位点ｓ１和ｓ２，其中 ｓ１位点有３个基因型，而ｓ２位点有５个基因型，处于高度多态（ＰＩＣ＝０．７０７８）和高度杂合（ｈ＝０．７０７８），该位点上遗传多样性 很丰富，在品系培育上选择潜力很大；Ｓ１位点的ＡＢ基因型和ｓ２位点的ＡＣ基因型都与滩羊二毛皮的毛股自然长度有明显关 系，可作为分子标记用于二毛裘皮较长毛股自然长度潍羊品系定向选育。 【关键词】滩羊；ＫＡＰ１．１；ＰＣＲ—ＳＳＣＰ；裘皮性状 【中图分类号】Ｒ３２【文献标识码】Ａ ＴＨＥ Ｓ彻Ｙ ｏＮ ＫＡＰ１．１１ ＧＥＮＥ ＰｏＬＹ］ＭｏＲ唧ＢＥＴⅥ ＥＮ ＴＨＥ ＧＥＮＥ ＰｏＹＹＭｏ删ＳＭ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＩｏＮＳＨＩＰ ＩＳＭ ＡＮＤ ＬＡＭ口Ｅ｜ ＩＮＰｏＲＴＡＮＴ ＦＵＲ ＴＲＡＩＴＳ ｏＦ ＮＩＮＧＸＩＡ ＴＡＮ ＳＨＥＥＰ Ｊｉａ Ｈｕａ ｅｔ ａｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｍｏｍｙ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ７５０００４，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｗｅ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｔａｎ ＫＡＰ１．１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏ￣ ｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｒ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｌａｍｂ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｗｏｏｌ ｆｉｂｅｒ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｅｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｎ￣ｕｒａｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｗｏｏｌ ｓｔｏｃｋｓ ｉｎ ＯＭｅｒ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ—ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｒ ａｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｈｅｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｗｏｒｋ．Ｍｅｔｈｍｌｓ：ＰＣＲ—ＳＳＣＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｓｅ ＫＡＰ１．１ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ２６１ ｌａｍｂｓ．Ｔｈｅｎ，ｓｏｆｔｗａｒｅ ＤＰＳ７．０５ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｓｅ ｔｈｅ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｍｅａｎ （ＬＳＭ）ｏｆｆｕｒ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ ｔｗｏ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆｔｈｅｍ ｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｈａｔｔ ＫＡＰ１．１ ｇｅｎｅ ｈａｓ Ｓ１ ａｎｄ ｓ２ ｔｗｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ Ｓ１ ｌｏｃｕｓ ｈａｓ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，ａｎｄ ｓ２ ｌｏｃｕｓ ｈａｓ ｆｉｖｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｉｎ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｅｎｄｉｎｇ ｏｆ ｗｏｏｌ ｓｔｃｋｓ ｔｒａｉｔｓ，ｔｈｅ ＬＳＭ ｏｆ Ｓ１一ＡＡ ｉｓ ｈｉｏｇｈｅｒ ｔｈａｎ Ｓ１一ＡＢ ａｎｄ Ｓ１一ＢＢ，ｂｕｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｏ－ ｔｙｐｅｓ（Ｐ＞０．０５）；Ｔｈｅ ＬｓＭ ｏｆ ｓ２一ＡＢｉｓ ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ ｓ２一ＡＡ，ｓ２一ＢＢ，ｓ２一ＡＣａｎｄ ｓ２一ＤＤ，ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓ ｎｏ ｓｉｎｉｇｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒ－ ｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｉｆｖｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｉｎ ｎａｔｕｒｌａ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆｗｏｏｌ ｓｔｃｋｓｏ ｔｒａｉｔｓ，ｔｈｅ ＬＳＭ ｏｆＳ１一ＡＢ ｗａｓ ｓｉｎｉｇｉｆｃａｎｔｌｙ ｈｉｈ－ｇ ｅｒ ｈａｎ Ｓ１一ＢＢ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄ ｔｔｈｅ ＩＳＭ ｏｆ Ｓ２一ＡＣ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ Ｓ２一ＢＢ（Ｐ＜０．Ｏ１）．Ｉｎ ｔｈｅ ｗｏｏｌ ｉｆｅｒｂ ｉｆｎｅｎｅｓｓ ｔｒａｉｔｓ，ｔｈｅ ＬＳＭ ｏｆ Ｓ１一ＡＡ ｉｓ ｌｏｗｅｒ ｈａｔｎ Ｓ１一ＡＢ ａｎｄ Ｓ１一ＢＢ，ｂｕｔ ｎｏ ｓｉｎｉｇｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ（Ｐ＞０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＫＡＰ１．１ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｔａｎ ｓｈｅｅｐ ｈａｓ ｔｗｏ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓ１ ａｎｄ ｓ２，ｉｎ ｗｈｉｃｈ Ｓ１ ｌｃｕｓ ｈａｏｓ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，ａｎｄ ｓ２ ｓｉｔｅ ｈａｓ ｉｆｖｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，ｗｈｉｌｅ ｓ２ ｓｉｔｅ ｉｓ ｈｉｇＭｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ（ＰＩＣ：０．７０７８）ａｎｄ ｈｉｈｌｇｙ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ（ｈ＝０．７０７８），ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒ－ 【基金项目】８６３计划（２００８ＡＡ１０１００１）；国家自然科学基金资助项目（３０７６０１７５） 【作者简介】 贾桦（１９８１一），女，讲师，博士，主要从事基础教学工作。 通讯作者：李爱华（１９５９一），女，研究员，硕士，主要从事动物营养与饲料科学方向研究。 牡丹江医学院学报 ２０１３年 第３４卷 第６期 ・２・ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＵＤＡＮＪＩＡＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳⅡＹ Ｖ０Ｌ ３４ ＮＯ．６ ２０１３ ｓｉｔｙ ｉｓ ｖｅｒｙ ｒｉｃｈ ａｎｄ ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ ｔｏ ｂｒｅｅｄ ｎｅｗ ｓｔｒａｉｎ；ＡＢ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ＳＩ ｓｉｔｅ ａｎｄ ＡＣ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ｓ２ ｓｉｔｅ ｂｏｔｈ ａｒｅ ｃｌｅａｒｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｗｏｏｌ ｓｔｏｃｋｓ ｉｎ Ｔａｎ ｓｈｅｅｐ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｉｔｅｓ Ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｂｒｅｅｄ Ｔａｎ ｓｈｅｅｐ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｎａｔｕｒａｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆｗｏｏｌ ｓｔｏｃｋｓ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｔａｎ ｓｈｅｅｐ；ＫＡＰ１．１；ＰＣＲ—ＳＳＣＰ；ｆｕｒ ｔｒａｉｔｓ 滩羊主要分布在宁夏，辐射甘肃、内蒙、陕西等狭窄生 子标记方法来研究其与羊毛经济性状的关系。本研究利用 态区的干旱半荒漠地区，属国家农业部重点保护的地方优良 ＰＣＲ—ＳＳＣＰ技术选取羊毛纤维结构蛋白ＫＡＰ１．１基因作为 品种之一，属我国特有的肉毛兼用绵羊品种。滩羊二毛皮产 候选基因来研究其与滩羊裘皮品质性状的关系，通过发现的 业在带动宁夏回族自治区社会效益和经济效益方面起着巨 多态位点，运用最小二乘均值（ＬＳＭ）分析各多态位点与滩羊 大的作用。因此，在基因水平上研究滩羊的遗传多态性对于 毛股弯曲数、纤维直径及毛股自然长度之间的关系，以达到 宁夏滩羊品种的改良具有积极的推动作用。角蛋白中间丝 准确、有效选择标记的目的，为改善滩羊的裘皮品质性状的 （ｋｅｒａｔｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌａｍｅｎｔ，ＫＲＴ—ＩＦ）和角蛋白辅助蛋白 早期标记辅助选择提供理论依据和技术贮备。 （ｋｅｒａｔｉｎ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＫＡＰｓ）是羊毛的主要结构蛋白， １材料与方法 其中ＩＦ有两个家族，即酸性（Ｉ型）和碱性（Ⅱ型）角蛋白。 １．１材料（１）样本采集：本试验所用２６１只二毛羔羊的血 角蛋白辅助蛋白（ＫＡＰ）包括三类：第一类为高甘氨酸酪氨酸 样分别采自宁夏朔牧盐池滩羊繁育有限公司（１００只）和宁 蛋白（ｈｉ【ｇｈ ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｙｒｓｉｎｅ ＫＡＰｓ），由ＫＡＰ６．ｎ多基因家族、 夏盐池滩羊选育场（１６１只）。采取静脉采血法，每只羔羊抽 ＫＡＰ７、ＫＡＰ８、ＫＡＰ１８～２２所编码；第二类为高硫角蛋白辅助 取５ｍＬ于装有ＥＤＴＡ的离心管中（已灭菌），冰盒运输，一 蛋白（ｈｉｇｈ ｓｕｌｆｕｒ ＫＡＰｓ），由ＫＡＰ１．ｎ、ＫＡＰ２．ｎ、ＫＡＰ３．ｎ、 ２０￣Ｃ保存，用于基因多态性分析。采取血样的同时采集相应 ＫＡＰ１０～１６等２３个家族编码，其中，ＫＡＰ１（高硫Ｂ２）这个家 个体肩部毛样，用于毛股弯曲度、毛股自然长度及毛纤维细 族中的三个成员ＫＡＰ１．１、ＫＡＰ１．２、ＫＡＰ１．３已得到蛋白质序 度的分析。（２）引物设计：根据ＧｅｎＢａｎｋ报道的绵羊ＫＡＰ１． 列，其长度分别为１７１、１５６和１５１个氨基酸，平均半胱氨酸 １基因的序列（Ｌ３３８８６．１ ＧＩ：４９９８７２），利用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件 的含量为２２ ｍｏ１％…；第三类是超高硫角蛋白辅助蛋白（ｕｌ— 设计该基因两对引物ｓｌ和ｓ２．（表１），引物序列由上海生物 ｒｔａ ｈｉｇｈｓｕｌｆｕｒ ＫＡＰｓ），由ＫＡＰ４．ｎ、ＫＡＰ５．ｎ、ＫＡＰ９、ＫＡＰ１７编 工程技术服务有限公司合成。（３）主要试剂与仪器：Ｔａｑ酶、 码 。根据国内外学者的研究，ＫＡＰ基因与羊毛品质存在 ｄＮＴＰ购于北京全式金生物技术有限公司；ＢｓｓｒＩ限制性内切 相关性 Ｊ。近年来，对绵羊ＫＡＰ基因的研究已有众多报道， 酶购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司。主要仪器有ＰＣＲ仪（Ｓ１０００ＴＭ Ｔｈｅｒ－ 一些学者利用微卫星分子标记对绵羊的遗传多样性和经济 ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ，美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）、电泳仪（ＰｏｗｅｒＰａｃＴＭ Ｂａｓ－ 性状间的关系进行了研究，并找到了与羊毛经济性状连锁的 ｉｃ，美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）及凝胶电泳成像系统（Ｕｎｉｖｅｒｓｌａ ＱＴＬ＿４ Ｊ。还有一些学者利用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ、ＰＣＲ—ＳＳＣＰ等分 Ｈｏｏｄ ＩＩ，美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）等。 表ｌ引物序列及退火温度 引物名称 引物序列（５ 一３ ） 扩增片段长度 退火温度／℃ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｌｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ 一ｊ ） Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ５ ＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣＣＴ ３ Ｓｌ １９６ ６２．５℃ ５ ＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＡ ３ ５ ＴＧＣ Ｉ’ＧＣＣＡＧＣＴＧ ＩＩＡＣＴＡＴＧＣＣ ３ ｓ２ １９０ ５９．８℃ ５ ＧＧＴＩＴＧＣ，ｒＩｆｒＧＣＴＹＣＣＣＣＣＴ ３ １．２试验方法基因组ＤＮＡ的提取，血液中的基因组ＤＮＡ 聚丙烯凝胶２１０ Ｖ电压下４ｍｉｎ，后８０Ｖ电压下，４￣Ｃ电泳 提取参照《分子克隆实验指南》中提供的酚：氯仿提取法。 ２００ｍｉｎ，银染显色。用凝胶成像系统照相、分析、判定各种基 １．２．２ ＰＣＲ扩增反应体系总体积为２５ ：１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２． 因型。 ５ Ｌ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．Ｏｇ＆，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ／Ｉ￣Ｌ） １．２．４羊毛品质分析利用羊毛测定仪测定羊毛的长度、 ０．３ ，上下游引物（１０ ｐｍｏｌ／ｐ，Ｌ）各０．５ ｌ，模板ＤＮＡ（５０ ｎＳ／ 弯曲数、细度。 ＩｘＬ）１．０ｐ，Ｌ，ｄｄＨ２０１８．２ Ｌ。反应条件为：９５℃预变性３ｍｉｎ； １．２．５数据统计 ９４℃变性３０ｓ；退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３５个循环；后７２℃延 （１）基因频率是指一个群体中某一基因对等位基因的相 伸５ｍｉｎ，４￣Ｃ保存。 对比率。 １．２．３ ＳＳＣＰ分析取ＰＣＲ产物２．０ｕＬ加入５ｐＬＬ的变性上 Ｐ ＝［２（ｉｉ）＋（ 。）＋（ ）＋……（ ）］／２ｎ （１— 样缓冲液，９８￣Ｃ变性１０ ｍｉｎ，立即冰浴５ｍｉｎ。１２％的非变性 １） 牡丹江医学院学报 ２０１３年 第３４卷 第６期 一 ・４・ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＵＤＡＮＪＩＡＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏ１．３４ ＮＯ．６ ２０１３ ＞ＰＩＣ＞０．２５为中度多态，ＰＩＣ＜０．２５为低度多态。对于一 ０．２９个，但三种基因型间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。ＡＢ基因 个群体而言，ＰＩＣ高、等位基因数目多、杂合度大，则该位点的 型滩羊毛股自然长度ＬＳＭ为９．３３ｃｍ，分别高于ＡＡ、ＢＢ基因 遗传变异性就高，有较大的选择潜力。由表２可知，滩羊ｓ１ 型０．１８和０．８６ｃｍ，其中，ＡＢ基因型滩羊显著高于（Ｐ＜０． 位点ＰＩＣ＝０．２２９８（＜０．２５），说明该位点处于低度多态，杂合 ０５）ＢＢ基因型滩羊。ＡＡ基因型滩羊毛纤维细度的ＬＳＭ为 度（Ｈｅ＝０．２６４８）较低。ｓ２位点ＰＩＣ＝０．７０７８（＞０．５），说明 ３６．３８ｕｒｎ，分别低于ＡＢ、ＢＢ基因型０．５１ＵＩｌａ和３．０８ｕｒｎ，但三 该位点为高度多态，且杂合度（Ｈｅ＝０．７０７８）也较高。ｓ２位 种基因型间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。ｓ２位点各基因型与二 点的有效等位基因数（Ｎｅ）高于ｓｌ位点，前者的遗传变异较 毛裘皮的毛股弯曲数、毛股自然长度及毛纤维细度的最小二 大。由于滩羊群体在ｓ２位点上遗传多样性很丰富，选择潜 乘均值（ＬＳＭ）和标准差如表４所示，ＡＢ基因型滩羊毛股弯 力很大，所以ｓ２位点可以作为宁夏滩羊裘皮品质性状的遗 曲数ＬＳＭ为６．５０，分别高于ＡＡ、ＢＢ、ＡＣ、ＤＤ基因型０．４、０． 传多样性分子标记位点。 ６４、０．４３和０．３１个，但五种基因型问没有显著差异（Ｐ＞０． ２．４位点不同基因型与二毛裘皮性状的关联性分析Ｓ１位 ０５）。ＡＣ基因型滩羊毛股自然长度ＬＳＭ为９．７７ｃｍ，分别高 点各基因型与二毛裘皮的毛股弯曲数、毛股自然长度及毛纤 于ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ、ＤＤ基因型０．２９、０．２８、１．２２和０．８２ｃｍ，其中， 维细度的最小二乘均值（ＩＳＭ）如表３所示，ＡＡ基因型滩羊 ＡＣ基因型与ＢＢ基因型间差异极显著（Ｐ＜０．０１）。 毛股弯曲数ＬＳＭ为５．９３，分别高于ＡＢ、ＢＢ基因型０．０９个和 表３ Ｓ１位点不同基因型与裘皮品质性状的关联性分析 位点 基因型 样本量 毛股弯曲数（ＬＭＳ±ＳＤ） 毛股自然长度（ＬＭＳ±ＳＤ） ３讨论 的细丝填充在ＫＡＰ的基质之间，低硫角蛋白家族在羊毛纤 本研究发现了宁夏滩羊ＫＡＰ１．１基因的两个多肽位点 维的角蛋白中间丝内部表达，其余家族在羊毛纤维的基质中 ｓ１和ｓ２，其中ｓｌ位点有３个基因型，ｓ２位点有５个基因型， 表达（朱学骏等，２００１） Ｊ。而角蛋白及亚家族编码基因存 且ｓ１位点的ＡＢ基因型和ｓ２位点的ＡＣ基因型都与滩羊二 在的多个（ＳＮＰ）突变与羊毛性状（细度、强度、弹性和弯曲度 毛皮的毛股自然长度有明显关系，可作为分子标记用于二毛 等）存在相关关系 。研究发现在ＫＡＰ１．１、ＫＡＰ１．３基因编 裘皮毛股自然长度较长的滩羊品系定向选育。该研究为今 码区发现了多个ＳＮＰ位点（Ｉｔｅｎｇｅ—Ｍｗｅｚａ等，２００７） ，本 后长毛股品系的二毛羔羊选育找到了有效的分子标记，但毛 研究以ＫＡＰ１．１为候选基因研究其多个ＳＮＰ位点与宁夏滩 股长度作为数量性状，是由多基因和多因素所控制和影响 羊二毛裘皮品质性状（毛股弯曲数、纤维直径及毛股自然长 的，本研究尚未涉及其它对毛股长度有影响的基因，且本研 度）的关系。刘贵芬等 选择２ｌ号染色体上高硫蛋白家族 究没有发现ＫＡＰ１．１基因多态性与二毛皮毛股弯数度之间 中ＫＡＰ１．１与ＫＡＰ１．３中的部分序列和１号染色体高甘氨酸 有关联，而二毛皮另一重要品质性状是毛股花穗的弯曲数， 一酪氨酸蛋白ＫＡＰ６．１的外显子进行研究，结果发现ＫＡＰ１． 通常以弯曲数多而著称。 １与ＫＡＰ１．３所在区域中位点Ｗ０８６６７与羊毛细度相关；本 已有的研究表明，在羊毛纤维发育过程中，角蛋白呈暂 研究表明，ｓ１位点ＡＡ基因型所对应的毛纤维细度ＬＳＭ低 时性和间隔性表达，等量的Ｉ型和Ⅱ型角蛋白形成８—１０ ｎｌｎ 于ＡＢ、ＢＢ基因型，但三种基因型间未达到显著差异（Ｐ＞０． 牡丹江医学院学报 ２０１３年 第３４卷 第６期 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＵＤＡＮＪＩＡＮＧ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏ１．３４ ＮＯ．６ ２０１３ ・５・ ０５）。Ｐｏｎｚ等 通过片段定位方法寻找控制羊毛性状的 ＱＴＬ，利用法国的合成品系ＩＮＲ４０１对４ｏ个微卫星标记进行 ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｏｒｔｅｘ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏ１．２００２，１１８（２）： ２２６—２３１． 了分析，结果发现在绵羊第３号、７号、２５号染色体上有调控 毛长（ＳＬ）的ＱＴＬ，张亚妮等 叫选择ＫＡＰ６．１（ｓ１位点）、 ＫＡＰ１．１（ｓ２位点）和ＫＡＰ１．３（ｓ３和Ｓ４位点）基因进行研究， ３ Ｉａｎ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐ，Ｉａｎ Ｒｏｂｅｒｔ Ｆ．Ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ＱＴＬ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｗｏｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ’ｑｕａｌｉｔｙ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｕｐｐ１．）．２００５： ｓ９７一Ｓ１０７． ４ Ｊｉｎ Ｍ，Ｇｕｏ ＣＬ，Ｈｕ ＪＨ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｒｒｅｌ￣ｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ Ｌｉａｏｎｉｎｇ ｎｅｗ ｂｒｅｅｄ ｏｆ Ｃａｓｈｍｅｒｅ ｇｏａｔｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｍｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ．Ａｅｔａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｎｉｃａ．２００６，３３：２３０—２３５． 发现ｓ２一ＢＢ基因型可作为体重和产绒量性状等多性状标记 辅助选择的标记。 本研究结果表明ｓｌ位点处于低度多态，ｓ２位点处于高 度多态（ＰＩＣ＝０．７０７８）和杂合度也较高（ｈ＝０．７０７８），ｓ１一 ＡＢ和ｓ２一ＡＣ基因型可以作为毛股自然长度性状上的标记 基因型。说明滩羊群体在ｓ２位点上遗传多样性很丰富，选 择潜力很大，ｓ２位点可以作为有效的遗传标记用于宁夏滩羊 裘皮品质性状的遗传多样性分析；Ｓ１一ＡＢ和ｓ２一ＡＣ基因型 可以作为分子标记用于毛股自然长度较长的滩羊二毛裘皮 ５朱学骏，陈喜雪，李冠群，等．角蛋白相关遗传性皮肤病基因突变 的研究进展［Ｊ］．中华皮肤科杂志，２００１，３４（５）：４０３—４０４． ６管峰，石国庆，刘守仁，等．角蛋白家族及其对羊毛生长发育的调 控［Ｊ］．生命的化学，２００７，２７（１）：９２—９４． ７ ｈｅｎｇｅ—Ｍｗｅｚａ ＴＯ，Ｆｏｒｒｅｓｔ ＲＨ，ＭｃＫｅｎｚｉｅ ＧＷ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ＫＡＰ１．１，ＫＡＰ１．３ ａｎｄ Ｋ３３ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍｅｒｉｎｏ ｓｈｅｅｐ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．２００７，２１：３３８—３４２． 用品系筛选。而与二毛裘皮毛股自然长度相关的其他基因 及与二毛裘皮毛股弯曲度有关的基因还有待于进一步挖掘。 参考文献 １ ＧｏｎｇＨ，ＺｈｏｕＨＴ，Ｙｕ ＺＤ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｏｖｉｎｅ ｋｅｒａｔｉｎ —８刘桂芬，田可川，张恩平，等．优质细毛羊羊毛细度的候选基因分 析［Ｊ］．遗传，２００７，２９（１）：７０—７４． ９ Ｐｏｎｚ Ｒ，Ｍｏｒｅｎｏ Ｃ，Ａｌｌａｉｎ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｅｘｐｌｍｎｅｄ ｂｙ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒｗｏｏｌ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ｖｉａ ａ ｓｅｇｍｅｎｔｍａｐｐｉｎｇ印一 ｐｍａｃｈ．Ｍａｍｍ Ｇｏｎｏｍｅ．２００１，１２：５６９—５７２． １Ｏ张亚妮，张恩平，吴迪，等．内蒙古绒山羊ＫＡＰ基因与经济性状 关系的研究［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００７，３８（５）：４４７—４５１． ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＫＡＰ１—２ ｇｅｎｅ（ＫＲＴＡＰ１—２）．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１１．２０：８１５—８１９． ２ Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ，Ａｏｋｉ Ｎ，Ｒｏｇｅｒｓ Ｍ Ａ，ｅｔ ａ１．ｈＫＡＰＩ．６ ａｎｄ ｈＫＡＰ１．７， Ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｓｕｌｆｕｒＫｅｒａｔｉｎ—－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ——ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｌｅ ｅｘ— 收稿日期：２０１３—０７—２５ 表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂继发耐药后插入化疗的Ⅱ期临床研究 李大鹏 曹莉莉 冯 军徐红 陶敏李玮 （苏州大学附属第一医院肿瘤科 江苏 苏州 ２１５００６） 【摘要】 目的：探讨表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂继发耐药后，化疗插入酪氨酸激酶抑制剂的疗效及安全性。方法：纳 入我中心２０１１—１０—２０１３—０５就诊的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的晚期肺癌患者，每３周行姑息化疗并第２～ １６ｄ插入酪氨酸激酶抑制剂治疗。每两周期评价近期疗效。治疗前及治疗２～４周期后进行生活质量ＱＬＱ—Ｃ３０问卷调查。 结果：纳入的２３例患者中，共有ＰＲ ７例（２１．９％），ＳＤ１８例（５６．３％），ＰＤ７例（２１．９％），无惠者获得ＣＲ。ＲＲ为２１．９％，ＤＣＲ 为７８．１％。中位ＰＦＳ为８．６个月，中位总生存时间（ＯＳ）１３．６月。生活治疗总分显著提高。躯体功能标化分明显升高（Ｐ： ０．００２）．治疗后呼吸困难较前明显改善（Ｐ＝０．０００）。主要不良反应为白细胞减少、中性粒细胞减少及恶心呕吐。结论：在ＥＤ ＦＲ—ＴＫＩ继发耐药后，采用化疗并间隙插入ＴＫＩ的方法 仍可使患者获得较长的ＰＦＳ和ＯＳ。该部分患者的生活质量仍可获 益，且不良反应在可接受范围内。 【关键词ｌ非小细胞肺癌；表皮生长因子酪氨酸激酶抑帝ｌ剂；耐药；生活质量；生存时间 【中图分类号】Ｒ７３【文献标识码】Ａ 【作者简介】 李大鹏（１９８０一），男，主治医师，硕士，主要研究方向为肿瘤综合治疗和生物治疗。 【基金项目】 莫阶平医学基金会临床科研专项资助基金（３２ｏ．６７５３．１２２５） 通讯作者：李玮（１９８１一），女，助理研究员，硕士，主要研究方向为肿瘤生物治疗。