HPLC法测定盐酸林可霉素注射液中林可霉素的含量

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ｄｏｉ：

ＨＰＬＣ法测定盐酸林可霉素注射液中林可霉素的含量

包爱情，陆春波，林仙军，陈晓林，蔡文金

［收稿日期］２０１７－０３－２１　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００２－１２８０（２０１７）１２－００４７－０５　［中图分类号］Ｓ８５９．８３

（浙江省兽药饲料监察所，杭州３１１１０１）

［摘　要］　建立并验证了高效液相色谱法测定盐酸林可霉素注射液中林可霉素含量的方法。试验采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），以０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二铵－乙腈（７５∶２５，Ｖ／Ｖ）为流动相，流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３０℃，波长为２１４ｎｍ。试验结果表明林可霉素在０．１～４．０ｍｇ／ｍＬ范围内线性良好，Ｒ２＝１．００００，平均回收率为９８．７％（ｎ＝９），ＲＳＤ为０．８％。与《中国兽药典》２０１５年版一部收载的方法相比，本研究开发的方法优化了流动相，流动相含盐量大大降低，林可霉素峰形更尖锐，理论板数更高。本方法简便、准确、可靠，可用于盐酸林可霉素注射液的质量控制。

［关键词］　盐酸林可霉素注射液；含量测定；高效液相色谱法

ＣｏｎｔｅｎｔＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＬｉｎｃｏｍｙｃｉｎｉｎＬｉｎｃｏｍｙｃｉｎＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｄｅ

ＩｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣ

ＢＡＱＡｉ－ｑｉｎｇ，ＬＵＣｈｕｎ－ｂｏ，ＬＩＮＸｉａｎ－ｊｕｎ，ＣＨＥＮＸｉａｏ－ｌｉｎ，ＣＡＩＷｅｎ－Ｊｉｎ

（ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇａｎｄＦｅｅｄｓｔｕｆｆ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１１１０１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎｉｎｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｄｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｖａｌｉｄａｔｅｄ．ＡｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｗｉｔｈａｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｏｆ０．０２ｍｏｌ／Ｌｄｉａｍｍｏｎｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎ－ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（７５∶２５，Ｖ／Ｖ）ａｔａｆｌｏｗｒａｔｅｏｆｔｈａｔａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗａｓａｃｃｅｐｔｅｄｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ０．１～４．０ｍｇ／ｍＬ（Ｒ２＝１．００００），ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ９８．７％（ｎ＝９）ｗｉｔｈＲＳＤｏｆ０．８％．ＩｎｃｏｎｔｒａｓｔｗｉｔｈｍｅｔｈｏｄｉｎＣｈｉｎｅｓｅｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｏｆｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎｗｅｒｅｉｍｐｒｏｖｅｄ．Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄｗａｓｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｄｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．（ＨＰＬＣ）

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｄｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

１．０ｍＬ／ｍｉｎａｎｄａｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ３０℃．Ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ２１４ｎｍ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ

２０１５，ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｓａｌｉｎｉｔｙｗｈｉｌｅｔｈｅｐｅａｋｓｈａｐｅａｎｄｎｕｍｂｅｒｏｆｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｐｌａｔｅｓ

作者简介：包爱情，从事兽药检测工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂａｏａｉｑｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ

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中国兽药杂志２０１７年１２月第５１卷第１２期　　ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇ

　　林可霉素属于林可胺类抗生素，主要作用于细菌核糖体的５０ｓ亚基，抑制肽链延长，干扰细菌蛋白质合成，属生长期抑菌剂。盐酸林可霉素注射液属于人畜共用药，对人与动物的革兰氏阳性菌和支原体感染都有较好的作用［１］。兽用盐酸林可霉素注射液，收录于《中国兽药典》２０１５版一部［２］，其中但该方法使用的流动相为０．０５ｍｏｌ／Ｌ硼砂溶液（用８５％磷酸溶液调节ｐＨ值至５．０）－甲醇－乙腈（６７∶采用高效液相色谱法对含量和有关物质进行测定。

乙腈（７５∶２５，Ｖ／Ｖ）；流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；温度３０℃；检测波长２１４ｎｍ；进样量１０μＬ。在此色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图１。在《中国兽药典》２０１５年版一部中的条件下对照品色谱图见图２。２．２　溶液的制备

２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相：０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二铵－

２．２．１　对照品溶液　精密称取林可霉素对照品１００ｍｇ，置２５ｍＬ棕色容量瓶中，加流动相约３３液，∶在流动相配制时硼砂溶解需要较长的时间２，Ｖ／Ｖ），该流动相中使用了高浓度的硼砂溶，且高浓度的盐溶液对色谱柱和液相系统都有较大的损害，长期处于高浓度的盐溶液中，将大大缩短色谱柱和仪器寿命［３］形有前沿现象，峰宽过大容易干扰有关物质的测。同时该流动相下林可霉素峰定。已经发表的文献中已经有较多涉及到对林可霉素的定量，化学发光法［４－５］细管色谱法［９］、气相法［１０］，但其中液相法多采用不同、气质法、酶联免疫法［６－８］［１１］、液质法［１２、－毛１３］和液相法［１４－１５］等方法浓度的硼酸溶液作为流动相。开发一种新的液相方法来改善以上问题，既可以提高检测效率，又可以延长仪器和耗材寿命。本文改进了流动相，开发了高效液相色潽法测定盐酸林可霉素注射液含量的方法，并对方法进行了验证。１　材　料

１．１　伦二极管阵列检测器仪器　Ａｇｌｉｅｎｔ１２６０，美国高效液相色谱仪Ａｇｌｉｅｎｔ公司；，ＸＳ配安捷－２０５电子天平，瑞士ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ公司；ＫＱ－５００Ｅ型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

１．２　ＫＧａＡ试－Ｑ超纯水公司剂与。，其余试剂均为分析纯材料　甲醇、乙腈为林可霉素对照品（来源；实验用水为色谱纯，Ｍｅｒｃｋ：ｍｉｌｌｉ检定研究院，批号：１３０４３２－２０１５１０，含量中国食品药品

：８５．５％）；盐酸林可霉素注射液供试品（批号分别为２０１６１２０１、２０１６１２０２、２０１６１２０３，由浙江某厂生产。规格１０ｍＬ∶１ｇ），２　方法与结果

２．１　色谱条件　色谱柱：ＡｇｉｌｅｎｔＣ１８ＸＤＢ（４．６ｍｍ×

２０度，ｍＬ，作为对照品储备液超声５ｍｉｎ，冷却至室温（约４ｍｇ，／用流动相稀释至刻ｍＬ）。精密量取适量，用流动相稀释成２ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液，即得。２．２．２　液适量，供试品溶液用流动相定量稀释制成每　精密量取盐酸林可霉素注射ｌｍＬ中含林可霉素２ｍｇ的溶液，摇匀。２．３　２．３．４ｍｇ１方法学考察

／　ｍＬ）线适量性范，围用流动相稀释成　精密量取对照０．品１，０．贮２，０．备液５，１，

（约２密量取ｍｇ／ｍＬ１０的系列对照品溶液μＬ，注入色谱仪，记录色谱图，按上述色谱条件，测定峰面，精积，以峰面积积分值（Ｙ）对浓度（Ｘ，ｍｇ／ｍＬ）进行线性回归计算，方程为：Ｙ＝２２０９．４Ｘ－１８．７（Ｒ２１．００００），性范围内线性范围，林可霉素浓度与峰面积呈现良好的线性０．１～４．０ｍｇ／ｍＬ。结果表明在线

＝关系。

２．３．２　按上述色谱条件精密度试验，连续重复进样　精密吸取对照品溶液６次，记录峰面积１０μＬ，，计算结果，林可霉素峰面积的ＲＳＤ为０．４％，表明仪器精密度良好。

２．３．２０１６１２０２），３　稳定性试验　取同一供试品溶液（记录色谱峰面积分别在，林可霉素峰面积的０、１、２、４、６、８、１２、２４ＲＳＤｈ进样批号为１００．７％。μＬ，结果表明供试品溶液在室温下放置２４ｈ稳定。２．２０１６１２０２），３．４　重复性试验　取定供试品溶液中林可霉素的含量照２．２．２项下方法制备供试品溶液同一批供试品（批。结果测得林可，号测霉素的峰面积分别为４５９２．１、４５９８．１、４５６９．３、４５８９．１、４５３６．１良好。

和４５７８．１，ＲＳＤ为０．５％，表明方法重复性中国兽药杂志２０１７年１２月第５１卷第１２期　　ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇ

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图１　优化条件下（Ａ）对照品色谱图和（Ｂ）供试品色谱图（批号为２０１６１２０２）

Ｆｉｇ１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆ（Ａ）ｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅａｎｄ（Ｂ）ｔｈｅｓａｍｐｌｅ（ｌｏｔｍｕｎｂｅｒ：２０１６１２０２）ｕｎｄｅｒｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

图２　《中国兽药典》２０１５版条件下对照品色谱图

Ｆｉｇ２　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｕｎｄｅｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ２０１５

２．３．５　加样回收率试验　准确量取已知含量的盐酸林可霉素注射液（批号２０１６１２０２，规格为１０ｍＬ∶１ｇ，含量为１０３．６ｍｇ／ｍＬ）２５０μＬ，共９份，置２５ｍＬ量瓶中，按高（１２０％）、中（１００％）、低（８０％）三个浓

度水平分别添加林可霉素对照品，制得向已知含量制剂中添加已知测定物的添加样品，每个浓度水平的添加样品分别制备３份供试样。用流动相溶解并稀释至刻度，测定并计算回收率，结果见表１。

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中国兽药杂志２０１７年１２月第５１卷第１２期　　ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇ表１　回收率试验结果表（ｎ＝９）Ｔａｂ１　Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｃｏｖｅｒｙｔｅｓｔ（ｎ＝９）

样品中

林可霉素质量／ｍｇ

２５．９２５．９２５．９２５．９２５．９２５．９２５．９２５．９２５．９

编号Ｈ１Ｈ２Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｌ１Ｌ２Ｌ３Ｈ３

样品取样量／μＬ

２５０２５０２５０２５０２５０２５０２５０２５０２５０

加入量／ｍｇ３０．６８３０．２５３０．６４２５．１４２５．６９２５．８７２０．１２２０．１４２０．６５

测得总量／ｍｇ

５５．９９５６．０２５６．２６５０．３６５０．３１５０．６５４５．３６４５．８９４５．６２

回收率／％９９．０９９．８９９．５９８．７９７．５９７．８９８．６９９．７９８．０

平均回收率／％ＲＳＤ／％

９８．７０．８

２．３．６　耐用性　在优化的色谱条件下，比较了ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）和ＡｇｌｉｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢＣ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）色谱柱，结果表明，两者均能使林可霉素峰形尖锐；对温度进行了考察，在本文优化的流动相下选择温度为２５℃和３５℃时，除出峰时间发生变化外，其余变化很小；将流动相水相和有机相比例调整为７８∶２２和７２∶２８进行测试，结果表明，流动相比例的微调也仅能影响出峰时间，对峰形和理论塔板数影响甚小。不同品牌的色谱柱、不同流动相有机相与水相比例以及不同温度，均能满足试验需要，方法耐用性较强。

２．４　实际样品测定　取不同批号的盐酸林可霉素注射液，按２．２．２项下方法处理，按上述色谱条件进行测定，每个样品制备２份，计算样品中林可霉素的含量，取平均值。同时与《中国兽药典》２０１５年版一部比较结果（表２）。

表２　样品含量测定结果（标示量／％，ｎ＝２）Ｔａｂ２　Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｓ

（ｌａｂｅｌｌｅｄａｍｏｕｎｔ／％，ｎ＝２）

批号２０１６１２０１２０１６１２０２２０１６１２０３

本方法１０３．４１０４．０１０３．５

《中国兽药典》２０１５年版一部方法

１０３．０１０３．６１０３．１

两者偏差／％

０．２０．２０．２

３　讨论与小结

在波长选择上，由于林可霉素在２００ｎｍ左右有最大吸收波长，但该处容易受溶剂干扰，因此本文沿用《中国兽药典》中的２１４ｎｍ作为检测波长。

在流动相优化上，本文尝试了《中国兽药典》２０１５年版一部中的流动相，水－乙腈（７５∶２５，Ｖ／Ｖ），水－甲醇（６５∶３５，Ｖ／Ｖ），０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钾（用８５％磷酸调节ｐＨ至６．１）－乙腈（７５∶２５，Ｖ／Ｖ），以及０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二铵－乙腈（７５∶２５，Ｖ／Ｖ），上述流动相体系除最后一种外，其余均导致林可霉素峰形差；而最后一种则在峰形略差于本文选择的流动相，经过优化，选择了本文开发的流动相。由于《中国兽药典》中的流动相使得林可霉素峰有前沿现象，经优化后有很大改善，理论板数也由６２４５增加到１０２３９，分离性能更好。

使用本文开发的方法与《中国兽药典》２０１５年版一部方法进行比较，结果表明两者在测定盐酸林可霉素注射液含量时，结果基本一致。方法使用了常用的溶解性好的磷酸氢二铵作为水相的溶质，且配制流动相时不需要调ｐＨ，在配制流动相时缩短了时间，提高了检测效率，且低浓度盐溶液有利于仪器的长期使用。

本文开发的方法简便、准确、重现性好，能够有效的控制该产品的质量，为产品标准改进提供了研究基础。

中国兽药杂志２０１７年１２月第５１卷第１２期　　ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇ

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ｍｅｔｈｏｄｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ

ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｆｏｒｔｈｅｃａｌｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｏｆｔｈｅｉｒｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ，ｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ⁃ａｎｄｎａｌｙｓｉｓ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．２０１１，５６（４）：Ｊｏｕｒｎａｌ７３６－ｏｆ７４２．

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盐酸林可霉素的含量［Ｊ］．药学服务与研究，２０１２，１２（２）：　１３２－１３４．

ｉｎＳｈｉｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎＱＨ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｏｆｔｈｅｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ１３２－１３４．

ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅＣａｒｅａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ，ｅｙｅｇｅｌ２０１２，ｂｙＲＰ１２（－ＨＰＬＣ２）：（编辑：侯向辉）

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