木瓜蛋白酶对中华稻蝗蛋白水解及其抗氧化性的研究

・４・　陕西农业科学　木瓜蛋白酶对中华稻蝗蛋白水解及其抗氧化性的研究　金晓辉，段玉峰，丁红军，李尔春，王丽华　（陕西师范大学食品工程系，陕西西安７１００６２）　提要：对中华稻蝗蛋白酶解条件及其抗氧化性和水解度进行了研究，结果表明，蛋白水解的最佳条件　为：底物浓度３　，ｐＨ值７．Ｏ，温度５０＂Ｃ，水解时间６ｈ，加酶量为１Ｏ　。　关键词：稻蝗蛋白；生物活性肽；木瓜蛋白酶；抗氧化性；水解度　生物活性肽是来源于细菌，真菌，动植物等有　１．２．３蛋白浓度的测定考马斯亮蓝法［　。　重要生理功能的—类生物活性物质。通过蛋白水　１．２．４抗氧化性的测定邻苯三酚法［８］。　解而得到的活性肽较多的是抗氧化肽。如韩国的　１．２．５　水解度的计算［。］　水解度一ｈ／ｈ，￣×　Ｓｅ－－Ｋｗｏｎ　ＫＥＩ］等人利用该国丰富的恶鱼类资源，　１００　一（水解后游离氨基酸浓度一水解前游离氨　从鱼类加工厂的废弃鱼皮中通过碱性蛋白酶、链　基酸浓度）／（水解液蛋白浓度×ｈ　）×１００％。　霉蛋白酶、胶原蛋白酶经三步酶解制得了抗氧化　其中，ｈ一单位质量蛋白质中被水解的肽键　肽；陈美珍等［２　研究发现大豆分离蛋白酶解物具　的量；（ｍｍｏｌ／ｇ）；ｈ　一单位质量蛋白质中肽键的　有清除羟自由基的能力，以分子量５　１５４－－－１１　３５５　总量（ｍｍｏｌ／ｇ），根据稻蝗蝗虫蛋白中氨基酸的组　的肽段清除能力最强，其清除能力，主要与暴露的　成及含量求得ｈ　为７．４３。　氨基酸侧链基团和肽序列有关；许庆陵［３　等研究　１．３试验方法　了鲢酶解物对羟自由基的清除作用，并采用　１．３．１　中华稻蝗蛋白质组成分析　样品经　Ｓｅｐｈａｄｅｘ－－Ｇ２５分离纯化，对抗氧化组分高的进　６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣ１在ｌｌ０＂Ｃ下水解２２ｈ后，抽酸，定容。　行分子量的测定；吕世明Ⅲ等利用木瓜蛋白酶对　用美国贝克曼公司１２１ＭＢ型氨基酸自动分析仪　羽毛蛋白最佳水解条件进行了探索。　测定。　蝗虫作为昆虫的一类，它是直翅目（Ｏｒ—　１．３．２　中华稻蝗蛋白的提取工艺　蝗虫一破碎　ｔｈｏｐｔｅｒａ）蝗亚目（Ａｃｒｉｄｏｉｄｅａ）昆虫的总称。其体　一浸提一离心一上清液一丙酮沉淀一透析一千燥　内富含蛋白质，占干物质重的６６．３７　～　一粗蛋白。　８５．６７　。本论文设计通过对中华稻蝗蛋白酶法水　１．３．３稻蝗蛋白水解条件的确定研究木瓜蛋　解，并研究抗氧化活性，这方面的研究国内外目前　白酶的加酶量、温度（Ｔ）、ｐＨ、水解时间（ｈ）、底物　未见报道。　浓度（Ｓ）对中华稻蝗蛋白水解效果的研究。　１实验材料与方法　（１）酶量的影响：选定Ｓ一５　９／６，ｐＨ一７．０，温　度５０＂Ｃ，分别在酶量２％，４　，６　，８　，１０　条件　１．１试验材料　下水解６ｈ，测定水解液的抗氧化性及水解度，以　１．１．１原料中华稻蝗Ｏｘｙａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｔｈｕｎ—　确定最佳的加酶量，见表１。　ｂｅｒｇ）：采集于陕西西安地区，经生物学鉴定。　表１酶量对水解效果的影响　１．１．２试剂　木瓜蛋白酶：广州酶制剂厂；其它　底物浓度Ｓ（　）ｐＨ值　温度Ｔ（℃）　加酶量（　）　都为分析纯。　５　７．０　５Ｏ　２　１．１．３主要实验仪器１２１ＭＢ型氨基酸自动分　５　７．０　５Ｏ　４　析仪：美国贝克曼公司；ＵＶ－－２０００型分光光度　５　７．０　５Ｏ　ｂ　５　７．０　５Ｏ　８　计：尤尼柯仪器有限公司；　５　７．０　５０　１０　１．２分析方法　１．２．１酶活力的测定根据Ｆｏｌｉｎ酚法［引。　（２）温度的影响：选定Ｓ一５　，ｐＨ－－７．０，分别在　１．２．２氨基酸含量的测定茚三酮法［引。　４０，４５，５０，５５，６０＂Ｃ，在已确定的加酶量的条件下　收稿日期：２００７—Ｏ１—２１　维普资讯 http://www.cqvip.com

金晓辉等：木瓜蛋白酶对中华稻蝗蛋白水解及其抗氧化性的研究　・５・　水解６ｈ，测抗氧化性及水解度，以确定其最适反　应温度，见表２。　表２温度对水解效果的影响　（３）ｐＨ的影响：选定Ｓ一５　和已确定的温　度、加酶量条件下，分别在ｐＨ值６．０，６．５，７．０，　７．５，８．０条件下水解６ｈ，测其抗氧化性及水解度，　确定其最佳ｐＨ值，见表３。　表３　ｐＨ值对水解效果的影响　（４）时间的影响：如表４所示，选定Ｓ＝５　和　确定的温度、加酶量、ｐＨ值，分别在２、４、６、８、１０ｈ　条件下酶解，测其抗氧化性及水解度，以确定其最　适反应时间。　表４水解时间对水解效果的影响　（５）底物浓度的测定：在已确定的温度、加酶　量、ｐＨ值、水解时间的条件下，测定底物浓度为　１　、３　、５　、７　、９　后的抗氧化性及水解度，以　确定其最适反应浓度，见表５。　表５底物浓度对水解效果的影响　２试验结果与讨论　２．１中华稻蝗的氨基酸组成　表６中华稻蝗氨基酸组成及含量　２．２茚三酮测定氨基酸的标准曲线　螫　Ｏ　５Ｏ　１００　１５Ｏ　蛋白浓度（ｕｇ／ｍ１）　图１茚三酮测定氨基酸的标准曲线　２．３考马斯亮蓝测蛋白浓度的标准曲线　Ｏ。６　Ｏ。５　Ｏ。４　０．３　螫　Ｏ。２　Ｏ．１　Ｏ　Ｏ　２Ｏ　４Ｏ　６Ｏ　８０　１００　蛋白浓度（ｕｇ／，－，）　图２考马斯亮蓝测蛋白标准曲线　２．４木瓜蛋白酶水解蝗虫蛋白条件的确定　２．４．１加酶量的确定不同酶量的水解效果见　图３。　维普资讯 http://www.cqvip.com

・６・　陕西农业科学　图３酶量的选择　从图３可以看出，随着加酶量由２　增加到　１２　其抗氧化和水解度都是先上升后下降。在酶　量达到１Ｏ　时，抗氧化性可达２８．９　，水解度达　２５．４　，随后又下降。综合考虑经济成本及实验效　率，确定最佳酶量为１Ｏ　。　∞　２．４．２水解温度的确定不同温度的水解效果　见图４。随着反应温度的升高，水解度和抑制率先　呈增加趋势，随后呈下降趋势，具体表现在５Ｏ℃　时蛋白水解率最高。这是因为一定范围内随着温　度上升，酶促反应速度加快，当温度超过最适温度　时酶活力下降，即产生温度最适极点。因此，５Ｏ℃　为该实验中最适温度。　３０　２０　ｌ０　０　４０　４５　５０　５５　６０　水解温度（℃）　图４水解温度的选择　２．４．３　ｐＨ值的确定不同ｐＨ值的水解效果见　图５。随着ｐＨ值的升高，在ｐＨ值７．０时水解度　和邻苯三酚的抑制率都达到最高，当ｐＨ值超过　７．０之后水解度和抑制率随ｐＨ值的增大而降低，　因此，选用ｐＨ值为７．０。　２．４．４水解时间的确定不同水解时间的效果　见图６。由图６可以看出增加反应时间有利于酶　解反应的进行。实验结果表明，开始一段时间增加　趋势缓慢，４ｈ过后增加趋势变陡，６ｈ后缓慢上　升，而邻苯三酚的抑制率在６ｈ时达到最大，所以　水解时间定为６ｈ。　３５　３０　２０　５．５　６．０　６．５　７．０　７．５　８．０　８．５　ｐＨ值　图５　ｐＨ值对水解效果的影响　柏　∞　加　Ｏ　２　４　６　８　ｌＯ　ｌ２　水解时间（ｈ）　图６水解时间的选择　２．４．５底物浓度的确定不同底物浓度的效果　见图７。由图７可以看出，随着底物浓度增加，抑　制率呈下降趋势，但水解度在中间出现一个最高　点，可能在该底物浓度下，酶的浓度和底物浓度比　例最适宜，有利于酶促反应的进行。因此选３　为　酶解反应的最适底物浓度。　０　ｌ　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　底物浓度（％）　图７底物浓度的选择　３　结论　本文研究了木瓜蛋白酶对中华稻蝗的水解条　件及抗氧化性能，确定其较优条件为底物浓度为　（下转第９页）　维普资讯 http://www.cqvip.com

周玉琴等：开麦１８丰产性、稳产性、适应性、抗逆性及品质分析　‘９‘　注：０表示免疫；Ｒ表示高抗；Ｍ表示中抗至中感ＩＭＲ表示中抗；Ｍｓ表示中感；ｓ表示高感。　２．５开麦１８的品质特点　物品质监督检验测试中心（郑＇￣Ｈ）２００３进行抽样　开麦１８籽粒卵圆形，籽粒大，半角质，色泽　测定结果开麦１８和加工品质指标达中筋粉标准　亮，饱满度好，容重高，外观商品性好，据农业部作　（见表５）。　表５开麦１８不同年度多点混样品质测定结果　３讨论　的增产作用。　我国面食品主要以蒸煮类食品馒头、面条和　试验结果表明，开麦１　８的产量构成三要素协　饺子为主，要求蛋白质和面筋含量适中，而面粉白　调，具有较好的丰产性、稳产性和适应性，其抗逆　度和口感则是实际应用中最重要的指标，开麦１８　性，经历了２００２－－￣２００３年度，播种期干旱，进入　的籽粒商品性好、加工品质符合我国食品品质及　分蘖期，大范围的降温天气，扬花期降雨等恶劣天　加工要求，比较适合机制和手工加工面条和馒头。　气。２００３－－￣２００４年度国家黄淮普遍播种推迟，春　开麦１８具有高产稳产广适、耐病的优良特　季倒春害危害。２００４－－￣２００５年度，小麦冻害普遍　性，亩成穗多，成穗率高，丰产潜力大，在黄淮麦区　偏重，春季，纹枯病，白粉病，赤霉病偏重发生，后　具有广阔的推广前景。它的育成和推广为小麦优　期干热风等不同环境的严峻考验，表现出较强的　质、丰产、稳产和广适性育种提供了借鉴思路，也　抗病性和抗逆性，在不同环境条件下，发挥出显著　为小麦高产优质育种提供了优良的亲本材料。　６　－６　－６ｑ・０　４ｑ　—　（Ｉ－接第６页）　９８４￣Ｉ　９８９・　．　３　，ｐＨ值７．０，温度５０￣Ｃ，水解时间６ｈ，加酶量　［２］陈美珍，余杰，郭慧敏．大豆分离蛋白酶解物清除羟自由基作　为１０　。在此条件下得到的中华稻蝗酶解液抗氧　用的研究Ｄ］．食品科学，２００２，２３（１）：４３￣４７．　［３］许庆陵，增庆祝，等．鲢酶解物对羟自由基的清除作用Ｉ－Ｊ］．水　化性（以邻苯三酚自氧化的抑制率表示）可达　产科学，２００４，（１）：９４￣９９．　３９　，水解度为４８　。但没有确定起作用的抗氧　［４］吕世明，谭艾娟，等．木瓜蛋白酶水解羽毛蛋白的最佳作用条　化肽进行分离纯化并进一步探讨它的作用机理，　件探索Ｄ］．贵州畜牧兽医，２００１，（３）：１～２．　这将作为以后试验的研究方向做这个方面的深入　［５］史锋．生物化学实验Ｉ－Ｍ］］．杭州：浙江大学出版社２００２．　研究。　［６］黄伟坤，等．食品检验与分析［Ｍ］．１９８９．　［７］陈钧，等．生物化学实验［Ｍ］．北京：科学出版社，２００３．　参考文献：　［８］孙雪奇，陈齐英，等．邻苯三酚自氧化法测定ＳＯＤ活性中测定　ＥＩ］Ｓｅ－Ｋｗｏｎ　ｋｉｍ，Ｙｏｎｇ－－ｔａｅ　Ｋｉｍ．ｅｔａｌ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃ—　波长的选择Ｄ］．华西药学杂志，２００４，１９（５）：４０４￣４０５．　ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｇｅｌａｔｉｏｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　［９］王何雅．牡蛎蛋白质的酶法水解及活性肽的研究Ｉ－Ｄ］］，硕士论　ｏｆ　Ａｌａｓｋａ　Ｐｏｌｌａｃｋ　ｓｋｉｎ［Ｊ］］．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，２００１，（４９）：１　文，２００３．