２０１０年１１月第４卷第２２期Ｃｈｉｎ ＪＭｏｄ ＤｒａｇＡｐｐｌ，Ｎｏｖ ２０１０，Ｖｏ１．４，Ｎｏ．２２ ・５・ 鹅不食草总黄酮的提取及对Ｓ１ ８０实体瘤抑 瘤作用的研究 刘力丰王尚 【摘要】 目的研究鹅不食草总黄酮的提取精制工艺，并探讨其抑瘤活性。方法 采用正交实验 优化乙醇提取工艺条件，同时采用大孔树脂、有机溶剂萃取、聚酰胺色谱等方法对总黄酮粗提物进行精 制。最后采用灌胃给药法研究鹅不食草总黄酮的抑瘤效果。结果 正交实验确定总黄酮最优提取条 件：７０％乙醇提取２次，每次２ ｈ，溶剂用量为８倍量。精制后总黄酮含量达到７６．２％。此外，鹅不食草 总黄酮对￥１８０实体瘤抑瘤率达到７１．９２％。结论 鹅不食草总黄酮提取与精制工艺简便、安全、可行。 鹅不食草总黄酮对￥１８０实体瘤有明显的抑制作用。 【关键词】 鹅不食草；总黄酮；正交实验；精制工艺；抑瘤活性 ｅ Ｅｘｔｒａｃｆｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｍｉｌ￣ａ（Ｌ．）Ａ．Ｂｒ．ｅｔ Ａｓｃｈｅｒｓ．ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅ￣ｏｎ Ｓ１８０ ＳｏＨｄ Ｔｕｍｏｒ Ｓｔｕｄｙ． 厶 ， ⅣＧ Ｓｈａｎｇ．Ｆｉｒｓｔ Ａｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＣｈａｎｇＣｈｕｎ Ｕｎｉｖｅｒｓ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｅ．ＣｈａｎｇＣｈｕｎ Ｊ３ＤＤ２ 。Ｃ ｉｎａ ｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｍｉｎｉｍａ（Ｌ．）Ａ．Ｂｒ．ｅｔ Ａｓｃｈｅｒｓ，ａｎｄ ｉｎｖｅｓｉｔｇａｔｅ ｉｔｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｗｈｉｌｅ ｕｓｉｎｇ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ，ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ ０ｆ ｔ０ｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｒｅｆｉｎｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｌｌｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ Ｗａｓ ７Ｏ％ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ，２ ｔｉｍｅｓ，ｅａｃｈ ｔｉｍｅ ２ ｈ，８ ｔｉｍｅｓ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔ．Ｕｐ ７６．２％ｃｏｎｔｅｎｔ ａｆｔｅｒ Ｒｅｆｉｎｅｄ ｔｏｔｌａ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｉｎ ａｄｄｉｉｔｏｎ．Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｍｉｎｉａ（Ｌ．）Ａ．Ｂｒｍ．ｅｔ Ａｓｃｈｅｒｓ．ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ Ｓ１８０ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｉｎ． ｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ Ｗａｓ ７１．９２％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ．ｓａｆｅ ａｎｄ ｆｅａｓｉｂｌｅ． Ｃｅｎｆｉｐｅｄａ ｍｉｎｉｍａ（Ｌ．）Ａ．Ｂｒ．ｅｔ Ａｓｃｈｅｒｓ．ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ Ｓ１８０ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｍｉｎｉｍａ（Ｌ．）Ａ．Ｂｒ．ｅｔ Ａｓｃｈｅｒｓ．；Ｔｏｔｌａ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；Ｒｅ－ ｉｎｉｆｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ；Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ 鹅不食草（Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｍｉｎｉｍａ（Ｌ．）Ａ．Ｂｒ．ｅｔ Ａｓｃｈｅｒｓ．）为菊 食草（采于吉林长白县，经长春中医药大学邓明鲁教授鉴定 科植物鹅不食草的干燥全草。据《本草纲目》记载有通窍，止 咳之功。主治风寒感冒，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻渊流涕等。 主要含有甾醇类、黄酮类、三萜皂苷类、挥发油类、胺类等成 为菊科植物鹅不食草）；芹菜素对照品（含量测定用，中国药 品生物制品鉴定所）；昆明种小白鼠，购自长春生物制品研究 所；小鼠Ｓ１８０肉瘤由中国医学科学院药物研究所引进；其余 试剂为分析纯。 ２方法 分…。近年来，针对其所含甾类、萜类成分研究较多，但对其 所含黄酮类成分研究较少，仅发现５个包括芹菜素在内的黄 酮类化合物 。故本课题以鹅不食草为原料，对其黄酮类 成分进行系统研究，并对其黄酮提取物进行药效学考察，最 ２．１鹅不食草总黄酮的提取与精制 ２．１．１正交实验优化总黄酮提取条件称取鹅不食草药材 ５００ ｇ，采用乙醇回流提取法提取总黄酮，为了寻求醇提的最 终为深入了解鹅不食草这一药用植物资源奠定基础。 １仪器与试药 佳工艺条件，采用４因素３水平依正交实验表 （３ ）进行正 交实验。考察因素为：提取溶剂、提取次数、提取时间以及溶 剂用量等四因素。因素水平表见表１。 ＵＶ一１７００型分光光度计（日本岛津）；ＢＦ２１１Ｄ电子天平 （德国赛多司）；烘箱；水浴锅；真空泵；超净工作台（ＣＪ．１）；自 动酶标仪（ＣｌｉｎｉＢｉｏ）ＥＣ，倒置显微镜（ＯＬＹＰＵＳ）Ｊａｐａｎ。鹅不 表１因素水平表 ２．１．２鹅不食草总黄酮的分离纯化称取５００ ｇ鹅不食草 萃取３次，弃去石油醚层。水层加氯仿回流提取３次，合并３ 次提取液合并３次提取液，减压回收氯仿，蒸干。干品加无 水乙醇溶解，将无水乙醇溶液加于处理好的聚酰胺中，蒸干 无水乙醇，干品加样于聚酰胺柱上，收集８０％乙醇洗脱液， 按正交实验确定的最佳工艺提取，减压回收乙醇，水浴锅 （６０℃）上浓缩干燥，干品加蒸馏水溶解上ＤＭ－３０１大孔树 脂，收集８０％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇，水浴锅（６０￣Ｃ） 上浓缩干燥，干品加蒸馏水溶解，石油醚（６０￣Ｃ一９０￣Ｃ）回流 作者单位：１３００２１长春中医药大学第一附属医院（刘力丰）；长 春中医药大学（王尚） ６Ｏ℃水浴蒸干，干品即为鹅不食草总黄酮精制品。 ２．２鹅不食草总黄酮的含量测定 ２．２．１对照品溶液的制备精密称取芹菜素对照品１０．３１ ｍｇ，置５Ｏ ｍｌ的容量瓶中，加８０％甲醇溶解并定容至刻度， ・６・ 中国现代药物应用２０１０年ｌ１月第４卷第２２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｏｄ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌ。Ｎｏｖ ２０１０。Ｖｏ１．４．Ｎｏ．２２ 备用。 照组：氯化钠溶液；阳性药组：环磷酰胺，按小鼠体重计算每 千克体质量给药２０ ｍｇ。小鼠灌胃给药，１次／ｄ，给药１５ ｄ后 ２．２．２样品溶液的制备精密称取鹅不食草正交实验所得 样品与总黄酮精制品各２０ ｍｇ，置１００ ｍｌ容量瓶中，加８０％ 甲醇８Ｏ ，密塞，超声２０ ｒａｉｎ，取出，放冷后用８０％甲醇定容 处死，称体重，摘瘤称重，计算抑瘤率，公式如下： 至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液０．１ ｍｌ置１Ｏ ｍｌ量瓶中 用８０％的甲醇定容至刻度，摇匀，作为样品溶液。 ２．２．３测定波长的选择—瘤重抑制率＝ｃ・一筹素 × ｏｏ％ 表２正交实验结果（以总黄酮量为指标） 对照品溶液和供试品溶液在２００ ４００ｒｉｍ进行扫描，发现均在２７０ ｎｍ处有最大吸收峰，故选 择测定波长为２７０ ｎｍ。 ２．２．４标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液０．１、０．２、 ０．３…０ ４ ０．５ ｍｌ，置１０ ＩＩｌｌ容量瓶中，加８０％甲醇稀释至刻 度，摇匀，以８０％甲醇为空白对照，于２７２ｎｍ测定吸光度，以 芹菜素溶液浓度（Ｃ）为横坐标，吸光度（Ａ）为纵坐标，绘制标 准曲线，得回归方程为：Ａ＝７５．６８１Ｃ－０．０７５８，ｒ＝０．９９９５（ｎ＝ ５）。结果表明芹菜素在２．１—１０．５ ｇ／ｌｎ１范围内与吸光度 呈良好的线性关系。 ２．２．５样品含量测定酮含量。 取样品溶液，在２７０ ｎｌｌｌ处测定吸光 度，将吸光度带人标准曲线，线性回归法计算鹅不食草总黄 ２．３鹅不食草总黄酮的抑瘤作用实验取荷瘤传代鼠脱颈 椎处死，固定于板上。用酒精消毒动物皮肤，切开皮肤，选择 肿瘤生长良好、无坏死或液化的瘤组织，加入无菌氯化钠溶 液，用组织匀浆器制成含３０００万／ｒＩｌｌ左右的细胞悬液，于小 鼠腋窝皮下接种０．２ ｍｌ／只，接种部位皮肤先用碘酊及酒精 消毒。每个瘤株，每次试验接种３６只小鼠，接种后次日随机 ３结果 ３．１乙醇回流提取法正交实验结果实验结果见表２和表 ３。从直观分析可知，以总黄酮量为指标进行分析时，因素 Ａ、Ｂ对结果均有影响，因素ｃ差异有统计学意义，最终确定 以总黄酮量为指标进行测定时，鹅不食草总黄酮的最佳提取 工艺为Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ１，即：７０％乙醇提取２次，每次２ ｈ，溶剂用 量为８倍量。 分组，每组１２只。试验组：按２．２项下制备鹅不食草总黄酮 精制品，按小鼠体重计算每千克体质量给药２００ ｍｇ；试验对 表３鹅不食草正交实验方差分析表（以总黄酮量为指标） ３．２鹅不食草总黄酮精制品的含量对鹅不食草总黄酮精 制品进行比色法检测，实验结果表明，鹅不食草总黄酮精制 品含量为７６．２％。 首次定量测定了鹅不食草总黄酮对Ｓ１８０实体瘤抑瘤活 性，实验结果证实其对Ｓ１８０实体瘤抑瘤的抑制作用较为明 显。此结果为该植物的开发、利用提供了科学依据和物质 基础。 ３．３鹅不食草总黄酮的抑瘤效果鹅不食草总黄酮精制品 对￥１８０实体瘤抑瘤作用进行试验，实验结果见表４。 ４讨论 参考文献 ［１］ 刘宇．鹅不食草的化学成分及生物活性研究进展．湖北中医杂 志，２ｏｏ５，２７（５）：５２３３． ［２］ｗｕ Ｊｉｎ－Ｂｉｎ，Ｃｈｕｎ Ｙｕｉ－Ｔｏ，Ｅｂｉｚｕｋａ Ｙｕｔａｋａ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｄｏｇｉｔａｌｌｙ Ａｅ－ ｔｉｒｅ Ｃｏｎｓｉｔｆｕ￣ｎｔｓ ｏｆ Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｍｉｎｉｒｎａ：Ｓｅｓｑｎｉ￣ｒｐｅｎｅｓ ｏｆ ＰｏｔｅｎｆｉＭ 采用正交实验法对鹅不食草总黄酮的乙醇提取工艺进 行了优选，文献记载 鹅不食草总黄酮有效部位中含有一定 量的芹菜素，故作者选择了以芹菜素为标准物测定总黄酮。 并以总黄酮含量为指标对醇提工艺进行了优化，结果表明其 有效部位的最佳提取工艺为：７０％乙醇提取２次，２ ｈ／次，溶 Ａｎｔｉ－ａｌｌｅｒｇｙ Ａｃｉｆｉｆ￣．Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ ＢｕＵ。１９９１，３９（１２）： ３２７２＿３２７５． 剂量为８倍量。按此结果提取鹅不食草总黄酮的提取效果 最好，且该工艺具有节省能源，成本低，简便易行等特点。 鹅不食草总黄酮粗提物经过大孔树脂、有机溶剂萃取、 聚酰胺色谱等方法处理后，总黄酮含量明显提高，达到７５％ ［３］ Ｙｕ Ｈ．Ｗ．，Ｗｒｉｇｈｔ Ｃ．Ｗ．，ｃａｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｐｒｏｔｏｚｏａｌ ＡｅｔＭｆｉｅｓ ｏｆ Ｃｅｎｄｐｅｄａ ｍｉｎｉｍａ．Ｐｈ￣ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，８：４３６－４３８． ［４］ Ｆｅｒｄｉｎａｎｄ Ｂｏｈｌｍａｎｎ，Ｃｈｅｎ Ｚｈｏｎ￣ｉｎｇ．Ｎｅａｗ Ｇｕａｉｎｏａｈｄｅｓ Ｆｒｏｍ Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｍｉｎｉｍａ．ＫｅＸｕｅ ＴｏｎｇＢａｏ，１９８４，２９（７）：９００－９０３． 以上，使总黄酮有效部位的含量达到可以考察其药理活性的 要求（一般要求有效部位含量达到５０％以上方可探讨其药 理活性），说明此精制工艺合理可行。 ［５］ 陈思妮，张振秋．紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含 量．中华中医药学刊，２００７，２５（１２）：２６３６－２６３７．