重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法的建立
首席医学网 2006年05月25日
【关键词】磺胺嘧啶银
摘要:目的与方法 通过探讨用MTT法检测重组人表皮生长因子（rhEGF）复方抗菌凝胶生物活性的试验参数，包括凝胶剂中卡波姆含量对测定的屏蔽作用、不同试剂对卡波姆组分屏蔽作用的解除、抗菌成分磺胺嘧啶银浓度以及EGF含量对复方凝胶检测方法的影响作用等，建立一套适合用于EGF复方抗菌凝胶剂生物活性的检测方法。结果 优选出的最佳条件：EGF质量分数为20 μg/g，卡波姆质量分数为1.0%，用尿素+PBS+甘氨酸作屏蔽剂，磺胺嘧啶分数浓度为0.5%~2.0%。结论 本文方法可快速准确地对EGF复方凝胶活性进行检测,从而为复方凝胶剂的开发提供条件。
关键词:重组人表皮生长因子;磺胺嘧啶银; 复方 ;凝胶剂 MTT法
表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)可明显促进创面愈合 ，尤其对一些难愈合创面作用更佳，具有很高的临床价值［1-6］。目前临床上主要使用基因工程生产的重组人表皮生长因子（recombinant human EGF, rhEGF）凝胶剂［7］。古巴的rhEGF凝胶与磺胺嘧啶银的复方制剂已经上市，国内也有数家单位正处于研发阶段［8,9］。在开发rhEGF复方抗菌凝胶的过程中，最大的困难在于rhEGF复方抗菌凝胶的生物活性检测问题。本文通过改良MTT［10］结合酶联仪的检测方法，对rhEGF复方抗菌凝胶几个组分浓度进行分析，拟建立了一套简便有效的检测方法。
1 材料和方法
1．1 细胞株
Balb/c3T3，由中国药品生物制品检定所提供。
1．2 培养基
RMIP 1640，购自GIBCO公司；
1．3 试剂
四甲基偶氮唑盐(MTT), 购自JANSSEN HIMICA公司；小牛血清(calf serum ，CS)，购自Hyclone公司；EDTA、NaCl、磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)、尿素、甘氨酸（上海生工公司），分析纯。
1．4 仪器
振荡器，购自德国IKA公司；酶标仪， BIOTEK公司。
1．5 样品
EGF国家标准品：由中国药品生物制品检定所提供，－20 ℃保存。
rhEGF复方凝胶样品［9］：自制，主要成分为rhEGF、磺胺嘧啶银、卡波姆，通过设定不同质量分数的卡波姆组分，测定其活性最佳的配方。
对照品：rhEGF水溶液，由桂林华诺威公司提供，用超纯水稀释成ρ=1 mg/mL的EGF溶液，待用。
1．6 细胞培养
将保存在液氮的Balb/c3T3细胞用含ρ=20％CS的RMIP 1640复苏培养再活化，然后用含ρ=10％CS的RMIP 1640培养基培养，传代1次，待铺展率达到70％~80％后用于检测。
1．7 rhEGF复方抗菌凝胶优化
Balb/c3T3细胞增殖MTT检测法 准确称取rhEGF复方抗菌凝胶 1.0 g，加入200 mL含ρ=0.4% CS的RMIP 1640培养基中，在混合器上振荡1 min，然后用0.22 μm的滤膜过滤，得到澄清滤液。以此滤液作为第一个稀释度（40），然后继续进行4倍稀释，至4-5，将各个稀释度样品加在已接种Balb3T3细胞的96孔板中，培养72 h，用MTT法于490 nm波长处检测活性。标准品的第一个稀释度（40）为50 IU/mL，同样4倍稀释至4-5。用同等浓度的水剂做对照；含ρ=10% CS 的RMIP1640培养基做阳性对照；含ρ=0.4% CS的 RMIP 1640培养基做阴性对照。
1．8 卡波姆干扰作用屏蔽剂的加入
将不同试剂分别与样品作用，旋涡10 min震荡分散，再加入甘氨酸，混匀，过滤，取滤液。
1．9 评估公式
样品效价（IU/mg）= 50IU×200×
标准品半效价量稀释度 样品相当于标准品半效价量稀释度
――50IU为标准品的第一个稀释度活性；
――200为样品预稀释度
2 结果与讨论
2.1 rhEGF凝胶中卡波姆组分对表皮生长因子生物活性测定的影响
以卡波姆为变量，分别配制几种不同质量分数卡波姆的EGF（20 μg/g）凝胶。凝胶外观为水溶性无色透明、质地均匀的凝胶制剂。随着卡波姆浓度的提高，凝胶剂的黏度相应提高。
样品处理参照“1.7”。根据对不同浓度卡波姆凝胶剂的生物活性测定，发现卡波姆成分在测定中，对细胞生长具有一定的抑制作用。随着卡波姆浓度的提高，其测出的生物活性与同浓度水剂对照品具有较大的差异，见图1。结果表明，ω=0.5%、1.0%的卡波姆对EGF
生物活性无显著影响，ω=2%、3%的卡波姆对EGF生物活性影响较大，综合考虑凝胶剂的铺展性和黏度，优选了卡波姆终质量分数为1.0%的凝胶作为备选浓度。
2．2 不同试剂对EGF复方抗菌凝胶屏蔽作用的解除
配制磺胺嘧啶银质量分数1.0%、EGF 20 μg/g的凝胶，用纯水+甘氨酸、EDTA+甘氨酸、PBS+甘氨酸、尿素+PBS+甘氨酸处理样品，取滤液检测生物活性。实验结果显示，复方抗菌凝胶对普通MTT法测活干扰较大，见图2。通过使用不同试剂对复方凝胶组分的干扰作用进行屏蔽实验，以纯水作为阴性对照，甘氨酸作为保护剂。从图2可看出，使用尿素+PBS屏蔽剂的效果较理想，其生物活性与同浓度水剂对照品生物活性基本一致。因此优选尿素+PBS+甘氨酸为EGF复方抗菌凝胶生物活性检测的屏蔽剂。
2.3 抗菌成分磺胺嘧啶银浓度对EGF生物活性检测的影响
以磺胺嘧啶银为变量，分别配制几种不同浓度磺胺嘧啶银的复方抗菌凝胶。用尿素+PBS+甘氨酸处理样品，取滤液检测活性。
磺胺嘧啶银成分对EGF凝胶剂生物活性测定具有干扰作用，不同浓度的磺胺嘧啶银具有不同的干扰效应，见图3。根据对不同浓度磺胺嘧啶银凝胶剂的生物活性测定，发现高质量分数的磺胺嘧啶银成分在测定中，对Balb/c3T3细胞生长具有较强的抑制作用，添加屏蔽剂的改良MTT法适用于ω=0.5%~2%的磺胺嘧啶银复方抗菌凝胶。
2．4 EGF浓度EGF凝胶生物活性检测的影响
准确量取自制EGF标准液，配制成不同浓度的凝胶剂。用尿素+PBS+甘氨酸处理样品，取滤液检测活性。结果见图4。从图4可看出，随着EGF含量的提高，测定的误差并无相应提高。说明EGF含量的提高，对生物活性检测并无太大干扰作用。考虑到治疗效果和经济效益问题，优选了终质量分数为20 μg/g的凝胶作为备选。
3 结 论
通过考察rhEGF复方抗菌凝胶内不同质量分数卡波姆、磺胺嘧啶银含量的对生物活性测定干扰程度，并选用不同试剂进行屏蔽，优选出一套快速精确的凝胶生物活性测试方法：EGF为ω=20 μg/g，卡波姆为10%，用尿素+PBS+甘氨酸作屏蔽剂，磺胺嘧啶为ω=0.5%~2.0%。使用该测试方法对凝胶剂内EGF不同含量进行生物活性测定，对照标准方法，确认该方法适合于EGF凝胶剂生物活性的快速测定。
参考文献：
［1］Brown GL, Nanney LB, Griffen J, et al. Enhancement of wound healing by topical treatment with epidermal growth factor［ J］. New Eng J Med,1989,321(1):76.
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［3］周学武，胡德耀，吴炎,等. EGF、磺胺嘧啶锌单用及伍用促进犬后肢枪伤部组织增生的作用［J］.中华创伤杂志，1995，11(3):322
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［5］谷庆阳，崔彩彬，高亚兵,等.外源性rhEGF对放射复合创伤伤口愈合的促进作用［J］.解放军医学杂志，2000,25(2):103
［6］张详明，周和平.细胞活素（rhEGF）Ⅱ期临床研究总结报告［J］.数理医药学杂志，1999,12(1):22
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［8］王世岭，郭振荣，周亮，等.重组人表皮生长因子对促进烧伤创面的愈合作用［J］.中国临床药理学杂志，1998，14(3):150
［9］陆兵，谢英华，程度胜，等.重组人表皮生长因子凝胶剂的研制［J］.药学实践杂志，2001,19(3):143
［10］Tim Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytoxicity assays［J］. J Immunological Methods,1983,63:55
1.广东药学院 微生物与免疫学教研室，广东 广州 510240;
2.桂林工学院 材料与化学工程系,广西 桂林 541000
3.广东药学院 药理学教研室，广东 广州 510240;
4.广西分析测试研究中心 生物化学分析室,广西 南宁 530022
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