★我国生命科学与生物技术发展现状
近 20 年来，生命科学与生物技术的飞速发展为世界各国医疗业、制药业、农业、环保等行业开辟了广阔的发展前景。作为 “ 对全社会最为重要并可能改变未来工业和经济格局的技术 ” ，生命科学与生物技术日益受到世界各国的普遍关注。中国作为一个拥有近 13 亿人口的大国，在人口与健康领域及农业领域面临着巨大的挑战，发展生命科学与生物技术对实现我国社会经济可持续发展有着重要的意义。
我国生命科学基础性研究的优先发展领域：基因组和功能基因组学、重大疾病相关基因的识别、分子生物学与生物化学、细胞和发育生物学、神经生物学、动植物区系的系统演化与协同进化、生物信息学等。
我国生物技术研究与开发重点领域：高产优质农作物的遗传育种、转基因技术和动物克隆、生物反应器、基因和蛋白质工程疫苗及药物、基因治疗等。 ★海洋微生物的优势
海洋微生物大多为陆栖微生物的变种，可以利用现有的许多商业化发酵工艺进行分离和培养，这使海洋微生物成一种可控制的资源，避免了海洋无脊椎动物研究中的资源问题。
与陆栖微生物相比,海洋微生物处在高盐、低温、高压和低营养物质等极端条件下。生存环境的的特异性，使海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上表现出多样性和特异性，相应产生一些特殊的活性代谢物质。因此从海洋微生物中发现新化合物的概率将比陆栖微生物要大的多。 ★海洋微生物的简单分类
根据分离菌样的来源，将发现生物活性的产生菌分为：海水细菌，沉积物细菌，微藻，共栖和共生细菌等 根据微生物生长所需的特殊条件又可分为：嗜压微生物、嗜冷微生物、嗜碱微生物、嗜热微生物等 ★海洋微生物的分类 细菌Bacteria 光能自养菌
厌氧光合菌：紫色光合细菌和绿色光合细菌 有氧光合菌：兰细菌；原绿植物菌
化能自养菌 硝化细菌；无色氧化硫细菌；甲烷氧化菌 化能异养菌
革兰氏阳性菌：产内孢棒状菌和球状菌；不产内孢棒状 菌；不产孢球状菌；放线菌及相关菌
革兰氏阴性菌：棒状菌和球状菌：好氧菌；滑动细菌；嗜细胞菌目；贝日阿托氏菌目；螺旋菌；螺状和弯曲状菌；发芽或附枝状细菌；衣原菌；粘液菌 真核生物Eucarya 光合自氧菌：微藻
化能异氧菌：原生动物门：鞭毛菌；阿米巴；纤毛菌 真菌： 高等真菌：子囊菌门；担子菌门
低等真菌：壶菌门；接合菌门 古生菌Archaea
化能自养菌：产甲烷细菌；嗜热酸细菌 化能异养菌：嗜盐细菌
非细胞类生物：病毒Viruses ★宏基因组 ( Metagenome)
(也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
★宏基因组学 (或元基因组学, metagenomics)
就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段, 以微生物多样性、 种群结构、 进化关系、 功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
★海洋微生物的分离与纯化方法 1、稀释涂布平板法
选用适合的培养基制成平板，将采集到的样品进行梯度稀释，从各稀释管中取0.2 mL分别滴于培养基表面，再用无菌玻璃棒轻轻涂匀，置适宜温度下培养。将培养后长出的单个菌落分别挑取后接入斜面，培养后涂片染色，用显微镜检查是否为单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直至获得纯培养株。 2. 稀释混合平板法
此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取0.5 mL的稀释水样滴入平皿，然后再倒入融化后冷却到45℃左右的培养基，边倒边摇匀，使样品中的微生物与培养基混匀，待冷凝成平板后倒置培养，待菌落长成后检查纯度。 3. 平板划线分离法
用接种环按无菌操作的要求，从水样或泥样悬液中取一环，在平板上连续划线或平行环线，适宜温度下培养2－7天，至长出单菌落，在显微镜下涂片检查是否为纯种。
★陈海水:将海水放置暗处贮放数周，待其所含杂质沉淀后，过滤而成的。 ★细菌分离和鉴定的依据
⑴ 形态特征⑵生理生化特征⑶生态习性⑷血清学反应⑸噬菌反应⑹细胞壁成分⑺红外吸收光谱⑻ＧＣ含量 ⑼ＤＮＡ杂合率⑽核糖体核糖酸（rＲNA ）相关度⑾rRNA的碱基顺序⑿核糖体蛋白的组成分析⒀其它 ★菌种的暂时保存方法
把菌种接种到斜面培养基上，置适温培养长出健壮的菌体，在较低温度下保存，海洋细菌可保存于15℃，以后每隔一定时间重新移种一次，移种时间间隔因菌种不同而异，几周至数月不等。该法简便易行，但保存时间短，易引起菌种的变异和退化。 ★菌种的长久保存法
（1）石蜡油封存法： 在斜面或半固体穿刺培养物上，加封一层液体石蜡，以防止培养基干燥并隔绝空气，降低菌种代谢率。一般4～5℃培养，有些15℃培养，半年到一年移种一次；
（2）冷冻真空干燥保存法： 将培养好的菌种斜面，加入保护剂（如牛奶），制成菌悬液，分装安瓿管，快速预冷（<-25℃），然后置真空干燥装置中使水分蒸发，至水分含量在1％-2％之间，熔封管口，避光保存低温或室温保存，可保存数年到30年。
（3）超低温保存法： 菌种分散于保护剂（如甘油，二甲亚枫），经预冷处理保存在液氮中，也可保存在-70℃超低温冰箱中。可保存30年以上。 ★基因突变
突变是指生物遗传性突然发生变异，影响生物遗传的表型现象，可遗传。可分为染色体畸变和基因突变，本质上都是基因突变。 ★基因突变的诱发因素 1) 细胞外诱发因素：
自然环境中存在的低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料及微生物产生的H2O2等都能成为生物突变的化学因素。
人造的紫外线、γ射线、X射线、快中子、激光、以及加热等都能成为基因突变的物理因素。人造的化学诱变剂有碱基类似物、烷基化及亚硝酸盐等。 2) 细胞内的诱发因素：
细胞代谢产生诱变剂，如H2O2、咖啡碱等。
许多微生物在陈旧培养基中易出现自发变异株就可能这个原因。 3) DNA分子内部因素：
DNA分子中的碱基存在互变异构效应。 ★突变的表现型可分为四类：
1）形态突变型；2）生化变异；3）致死突变型；4）条件致死突变。 ★基因突变的特点
1) 基因突变的自发性及不对应性 2) 基因突变的稀有性 3) 基因突变的独立性 4) 基因突变的可诱导性 5) 基因突变的稳定性 6) 基因突变的可逆性 ★诱变剂及其诱发机理
1）物理诱变剂：主要是辐射，如紫外线、X射线、γ射线、激光、和快中子等均是常用的物理诱变剂。 例如紫外线诱变，核酸类物质对紫外线的最大吸收峰值在265nm，也是微生物最敏感点。紫外线会造成DNA链断裂，或使DNA分子或分子之间发生交联反应，引起DNA复制错误，使正常碱基无法配对，造成错译或缺失，产生突变。
过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段DNA，或使交联的DNA无法打开，不能进行复制和转录，引起菌体死亡。紫外线对生物的效应有积累作用。
正常微生物细胞中，紫外线造成的DNA损伤可以得到及时修复，如紫外线处理后，细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会降低，即发生光复活作用。
2）化学诱变剂：常用的化学诱变剂根据其作用方式分为以下三种类型：
与核酸碱基发生化学反应的诱变剂：主要是烷化剂、亚硝酸和羟胺等。 烷化剂有单个或多个活性烷基，与DNA的碱基或磷酸作用，进行修饰或链间交联。亚硝基胍(NTG)和亚硝基甲基脲(NMU)的诱变效果突出，而称为“超诱变剂”。双烷化剂可引起DNA链交联，造成菌体死亡。
碱基类似物：包括2-氨基嘌呤(2-AP)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)等在DNA复制时，它们可被错误地掺入DNA，引起诱变效应。
移码突变的诱导剂：能够引起DNA分子中一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变的诱变剂。由移码突变产生的突变体称为移码突变体。 3）生物诱变：噬菌体、基因诱变剂 4）复合诱变
★微生物诱变育种的一般程序
★细胞培养：使用单个细胞悬液(是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。) ★组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）(把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长)
★器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫(系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。)
★原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养（在培养条件下传 １ 至 １０ 代 ）。
★传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（一般可传 ４０ 至 ５０ 代的细胞 ）。
★细胞株(cell strain)；从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群。
★细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，当细胞株传至50代以后又要出现危机，不能再传下去了。但有部分发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限地传下去，这类细胞称为细胞系。 ★培养细胞的特性 培养细胞的生长方式
★贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长,见于各种实体瘤细胞;
★悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面,见于各种造血系统肿瘤细胞。 ★贴附生长细胞的生长过程
游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟—4小时贴壁。 潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂， 机制：接触抑制、密度依赖性。 ★培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃
O2 （培养液与液面上的空间比1： 10或2~5mm，95%或100%饱和氧） CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒 ★消化液
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca、Mg的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 ★培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。
★一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清． ★常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 ★抗菌素
在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。
2+
2+
通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 ★培养细胞活力测定方法 一、细胞克隆形成率实验
单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆，克隆形成率可用来表示细胞的增殖能力： 克隆形成率＝克隆形成数／接种细胞数 此方法优点是精确、可靠但缺点是操作繁琐 二、台盼蓝法
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力（ 此方法基本已被淘汰）。 三、四唑盐（MTT）比色法
活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与其含量成正比，可用酶标仪测定OD值来进行定量研究。 此法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性实验、肿瘤放射敏感性实验等。 ★细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
★冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成、细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 ★植物组织培养：
在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。 ★植物组织培养优点
（1）快速。（2）周年生产。（3）经济效益高。 ★人工种子
又称人造种子，这是细胞工程中最年轻的一项新兴技术。最初是由英国科学家Murashige于1978年提出的。他认为利用体细胞胚发生的特征，把它包埋在胶囊中，可以形成具有种子的性能，并直接在田间播种。 人工种子是由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成。 ★植物组织培养的类型
按培养材料分为（Gamborg等)：愈伤组织培养；器官培养；细胞培养；原生质体培养 根据培养物量的多少：大量培养、微量培养。 根据培养过程中是否需光：光培养、暗培养
根据培养方法的不同：平板培养、微室培养、悬浮培养等 按培养过程分为:初代培养和继代培养
★初代培养（Primary culture）： 指外植体的最初培养。
★继代培养（Subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。
★细胞操作（cell manipulation）
又叫细胞工程（cell engineering）是指利用细胞融合和显微操作等方法对生物体的构成单位——包括体细胞和生殖细胞直接用手操作，创造出对人类有价值的物质和生命体的技术。
★细胞操作常用技术： 动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植。 ★单克隆抗体(百度)
由单一杂交瘤细胞克隆分泌的只能识别一种表位（抗原决定簇）的高纯度抗体。 ★抑制细胞分裂方法
1、 化学方法： 化学方法主要是利用能够抑制分裂的化学物质来干预细胞的分裂过程，从而达到预期的目的。常用的化学药品有：细胞松弛素B、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等。
2、 物理方法：物理方法是在细胞分裂周期中施加物理处理影响和干预细胞的正常分裂，达到预期目的。常用的方法有温度休克法和静水压等。 ★细胞融合（cell fusion）
又称细胞杂交（cell hybridization），是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。 ★细胞融合方法
1. 病毒诱导融合；2. 化学融合剂诱导融合；3. 电融合 ★海洋动物性别决定的特点
性染色体缺少或处于进化的初级阶段； 表型性别容易改变；
性逆转后个体具有正常的功能； YY型雄鱼可育
★遗传性别（genetic sex)：
在受精时通过一半来自卵子以及一半来自精子的染色体的结合而形成的，又称染色体性别。 ★鱼类主要有五大遗传性别：XX-XY，XX-XO，ZW-ZZ，ZO-ZZ，X1X1X2X2 -X1X2Y。 ★性逆转(Sex reversal)：有些鱼类还存在着由种质特性所决定的自然的性别转化现象。 ★胚胎学原理 ：
胚胎发育早期的生殖腺都由皮质部和髓质部构成，无性别分化。这时的生殖腺具有很强的可塑性，具有向雌性或雄性发育的潜能，如果皮质部得到发育，髓质部就退化，发育成雌性的卵巢；如果髓质部得到发育，皮质部退化，就发育成雄性的精巢。
★影响皮质部、髓质部发育的因素主要有： 1.遗传因素：
2.激素：性类固醇激素对鱼类性别的影响是显著的。雌二醇可使遗传上雄性青鳉转变成功能上雌鱼；甲基睾酮可使遗传上雌鱼转变为功能上的雄鱼。
3.环境因素，如温度：银汉鱼受精卵在17~25℃水温发育，雌体占12%，而在11~19℃发育，雌体占75%。 ★鱼类性别的人工控制途径
1、性激素处理；2、种间杂交；3、人工诱导雌核发育 ★自身免疫阉割
用某种鱼的精卵巢组织液作抗原物质，注射到同种异体幼鱼体内，使幼体内产生抗体，抑制其性腺发育，产生自身免疫阉割现象，从而产生中性不育鱼。这一技术已在鲑鳟鱼类获得初步成功。 ★海洋动物性别控制的意义
1、提高群体生长率；2、控制繁殖速度；3、延长有效生长期；4、提高水产品质量。 ★嵌合体：将两个遗传上不同的细胞混合起来发育得到的生物体。 ★嵌合体类别
按形成嵌合体的不同基因型组织的来源，嵌合体可分为同源嵌合体和异源嵌合体。 ★多倍体
是指体细胞中含有三个或更多个染色体组的个体，并依所含染色体组数顺次称为三倍体（triploid）、四倍体（tetroploid）等。 ★三倍体鱼类产生的机制：
一般认为是由于卵子受精后不排出第二极体所造成的，即卵子没有经过减数分裂而称为二倍体卵，再与正常的单倍体精子受精便形成三倍体。 ★三倍体诱导方法 一、抑制第二极体
二、抑制第一极体：方法与抑制第二极体类似，只是起始处理时间不同。 三、生物方法：通过四倍体与二倍体杂交 ★四倍体诱导方法
1、抑制极体释放（第一极体）； 2、抑制第一次卵裂；
3、细胞融合（合子－合子融合）； 4、人工雌核发育
通过精子染色体失活，再同时阻止第一、二极体释放来实现。 ★多倍体鱼类在养殖中的应用 1.控制过度繁殖
2.延长鱼类寿命 性成熟进行繁殖造成损失的鱼类。 3.改善鱼肉品质 三倍体香鱼肉味道比二倍体好。
4.三倍体杂种化 三倍体杂种具有杂种优势，并克服了种间杂种成活率低的难题，并有可能实现繁殖控制。 ★植物细胞工程
是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。 ★植物细胞融合
植物细胞A和B用酶解法（纤维素酶、果胶酶）去掉细胞壁，得原生质体A和B；原生质体融合（物理方法：离心、振动、点刺激。化学方法：聚乙二醇）得到杂合的原生质体，再生出细胞壁得到杂种细胞，杂种细胞筛选培养得愈伤组织，再分化发育得杂种植株。
★原生质体是去除了细胞壁被质膜所包围的、具有生活力的“裸露细胞”。
★原生质球是任何基因型的藻细胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分。
★原生质体分离中常用的酶
游离原生质体常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。 ★影响原生质体分离的因素
1.藻体材料：适宜材料是分离原生质体成功的关键,主要包括基因型、材料的类型及材料的生理状态等3个方面。一般为植物处于最佳生长状态最好。
2.渗压剂——渗透压稳定剂：渗压剂的使用浓度,一般控制在0·45~0·8 mmol/L范围内。 3.阳离子：高钙镁离子浓度(CaCl2和MgCl2)等能提高原生质体的产量和质量。 4.低速振荡及预处理 5.温度、酶解时间、光线等
★细胞融合方式：对称融合、供体-受体式融合 供体-受体式融合可分为细胞质杂交和不对称融合。
★细胞质杂种：两种来源不同的核外遗传成分与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种称做细胞质杂种。 ★胞质杂种的产生途径主要有：
1.一个正常原生质体与一个去核原生质体融合 2.一个正常原生质体与一个核失活原生质体融合 3.在异核形成后，两核中的一个消失 4.在较晚时期染色体选择性消失。 ★杂种细胞筛选
①利用或创造各种缺陷型或抗性互补细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来。 细胞系互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补及抗性互补。 ②利用或人为地造成两亲本原生质的物理特异性差异进行选择. ③利用或人为地造成细胞生长或分化能力的差异进行选择. ★细胞分化
在个体发育中，细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程，称为细胞分化。 ★细胞的发育潜能
全能性——具有能使后代细胞形成完整个体的潜能的细胞称全能性细胞。
多能性——具有分化出多种组织或细胞（但是不能形成完整个体）的潜能的细胞称多能性细胞。 单能性——只能分化成一种细胞的干细胞称单能干细胞 。 ★分化决定子
细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。 后来实验证明，细胞质中的分化决定子，是 RNA。 ★血清饥饿（百度）
这一种使细胞同步化分裂的方法。通过降低培养液中的血清浓度，使培养细胞因缺乏血清生长因子而不能分裂，一定时间后再加入血清，细胞就开始同步生长分裂了。 ★重新编程（repreogram, remodel）
细胞重新编程指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能分化的状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体。 ★克隆(cloning)
在生物学中它是指由一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。 ★胚胎分割(embryo splitting)
是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。
★胚胎细胞核移植(embryonic cell nuclear transplantation)
又称胚胎克隆，它是通过显微操作将早期胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术. ★体细胞核移植(somatic cell nuclear transplantation)
技术又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入去核卵母细胞中，构建新合子的生物技术。它与胚胎克隆技术相比，有两大优点:第一，同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二，可通过对供体细胞的遗传改造加速家畜品种改良或生产转基因动物。 ★干细胞（Stem cell）
即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。 ★干细胞的分类
按分化潜能：全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞 按发育状态：胚胎干细胞、成体干细胞 ★胚胎干细胞（ES细胞）
ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 ★胚胎干细胞的形态和生化特征
形态特征：体积小、核大，有一个或多个核仁；胚胎干细胞克隆紧密堆积，无明显的界限，形似鸟巢 生化特征：具有碱性磷酸酶和端粒酶活性；表达SSEA-3 (阶段特异性胚胎抗原stage specific embryonic antigen, SSEA) 、SSEA-4、TRA-1-60（肿瘤识别抗原）等；表达OCT-4蛋白；无X染色体失活。 ★胚胎干细胞具有以下特点 (1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2) 端粒酶活性高
(3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色
(4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞 ★横向分化：
部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。 ★基因工程：
在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 ★三大原件：供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 ★基因工程主要操作内容
1、目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化和PCR扩增等步骤，分理处带有目的基因的DNA片段。（切）
2、重组体的制备：将目的基因的DNA片段插入到能自我复制并带有选择性标记的（抗菌素的抗性）载体分子上，形成DNA重组分子。（接）
3、重组体的转化：经过重组体（载体）载入适当的受体细胞中。（转）
4、扩增DNA重组分子：短时间培养转化细胞，以扩增DNA分子或使其整合到受体细胞的DNA分子中。（增） 5、筛选的转化细胞：获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。（检） ★转基因动物（transgenic animal）：
就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 ★全基因鱼：
将鱼的启动子和鱼类本身的基因，例如鱼的生长激素基因拼接起来，构成重组体。 ★转基因鱼存在的问题
1. 外源基因的分离、定点整合和表达；2. 显微注射法；3. 环境问题；4. 转基因鱼筛选及品系建立 ★基因工程菌的特点
优点：生长快、表达水平高、载体丰富、 克隆方便 、已有大量产品上市
局限性：基因工程大肠菌（缺乏翻译后修饰功能、复杂蛋白表达水平低）；基因工程酵母（虽然存在翻译后修饰，但与哺乳动物细胞有较大区别 ） ★菌种鉴定
特性：菌体形态、生化（伯氏手册）、菌落形态等 纯种：是否污染杂菌、病毒样颗粒等 抗性鉴定：抗性是否丢失 质粒鉴定：酶切图谱 基因鉴定：核苷酸序列
表达水平鉴定：重组蛋白表达水平是否与原菌株一致 ★影响质粒稳定性的因素
工程菌生长期、产物表达期（分裂不稳定） 、温敏诱导、化学诱导剂 ★基因工程细胞的特点 具有完善的翻译后修饰功能 产物为活性形式，不需要复性 糖基化修饰，（抗体、EPO、受体等） 具有酰胺化、磷酸化等修饰功能 适合于复杂蛋白生产 抗体、酶、受体
★蛋白纯化过程
蛋白粗提(或包涵体制备) 、蛋白复性（可溶性表达产物不需）、蛋白浓缩和初纯化 、精纯化。 ★包涵体组成：未正确折叠的重组蛋白、细菌的核糖体和其它杂蛋白、质粒DNA、mRNA. ★包涵体的优点：易于得到重组蛋白的粗制品、对菌体无毒、表达水平高、目的蛋白不易降解。 缺点：复性回收率低，易产生异构体，是蛋白下游加工的一个瓶颈。 ★影响变性蛋白复性的主要因素
蛋白的特性、溶液中蛋白的浓度、变性剂及其浓度、复性体系的pH、氧化/还原剂、其它因素 ★蛋白的特性：蛋白的疏水性、结构的复杂性、二硫键的数量、其它未知因素 ★理想的复性方法应具备的特点： 1.活性蛋白的回收率高。
2.正确复性的产物易于错误折叠蛋白质分离。 3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。 4.折叠复性方法易于放大。 5.复性过程耗时较少。
★基因工程蛋白药物制备基本流程 (以包涵体形式表达的基因工程蛋白为例)
1)种子库的建立: 原始菌种→原始种子库→工作种子库 2)发酵: 工作种子库→种子液→发酵培养→离心收集菌体
3)蛋白变性和复性: 菌体破碎→离心收集包涵体→包涵体洗涤→蛋白变性→蛋白复性 4)蛋白纯化: 复性蛋白浓缩和初纯化→蛋白精纯化→无菌过滤→原液质检
5)制剂: 原液→稀释,添加保护剂→无菌过滤→半成品质检→分装→(冷冻干燥) →成品质检
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